齊 玲，溫 娜，楊淑艷，趙東海，王瑋瑤，韓 磊，金 宏

（1.吉林醫(yī)藥學(xué)院病理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心，吉林 吉林 132013）

腦腫瘤以惡性膠質(zhì)瘤最為多見，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)即處于晚期，預(yù)后極差。近年來研究[1－3]表明：腦腫瘤干細(xì)胞（brain tumor stem cells，BTSCs）是惡性膠質(zhì)瘤發(fā)生和耐藥的根源，但仍缺乏有效的治療腦腫瘤的藥物。順鉑是最常用的化療藥物之一，順鉑可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡[4]。但關(guān)于順鉑對BTSCs的作用及其機(jī)制尚未見報道。本課題組培養(yǎng)SHG-44膠質(zhì)瘤神經(jīng)球，對順鉑誘導(dǎo)神經(jīng)球凋亡的作用及其機(jī)制進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器 人腦膠質(zhì)瘤SHG－44細(xì)胞株由吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科提供；順鉑和MTT購自美國Sigma公司，RPMI-1640購自美國Hyclone公司，神經(jīng)培養(yǎng)基、小牛血清和B27添加物購自美國Gibco公司，人堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和人表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）購自英國PeproTech公司，Bax、Bcl-2和caspase-3抗體均購自北京中杉公司；CO2培養(yǎng)箱（CB150德國Binder公司），全自動酶標(biāo)儀（PLUS384美國MDC公司），超低溫冰箱（MDFU53V日本三洋公司），倒置顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.2 神經(jīng)球培養(yǎng) 自液氮罐中取出人腦膠質(zhì)瘤SHG-44細(xì)胞接種于含10%小牛血清的 RPMI－1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2和飽和濕度條件下進(jìn)行培養(yǎng)，隔日換液。待細(xì)胞生長至80%～90%，將SHG-44細(xì)胞以1×104cm－2的密度接種至75cm2培養(yǎng)瓶，加入干細(xì)胞培養(yǎng)液（stem cells media，SCM），包括神經(jīng)培養(yǎng)基、B27添加物、20μg·L－1EGF和bFGF。繼續(xù)培養(yǎng)，每3～5d換液1次，傳代時機(jī)械吹打使神經(jīng)球成單細(xì)胞懸液，按1∶2比例傳代，3代以后的神經(jīng)球用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測SHG-44神經(jīng)球生長抑制率取對數(shù)生長期的SHG-44神經(jīng)球，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105mL－1，以每孔100μL細(xì)胞懸液接種于96孔板中，置入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)設(shè)為對照組和順鉑組，每組5個復(fù)孔，對照組只加SCM，順鉑組加入含10mg·L－1順鉑的SCM，分別作用24、48和72h后棄上清，每孔加入MTT 20μL繼續(xù)孵育4h，棄上清后每孔加DMSO 150μL，震蕩15min使結(jié)晶充分溶解，在自動酶標(biāo)儀570nm波長處測定各孔吸光度（A）值，計算細(xì)胞生長抑制率：生長抑制率＝（對照組A值－實(shí)驗(yàn)組A值）/對照組A值×100%。

1.4 ELISA法測定神經(jīng)球培養(yǎng)上清中Bcl-2、Bax和caspase-3蛋白分泌水平 將SHG-44神經(jīng)球以1×105mL－1密度接種于24孔培養(yǎng)板中，實(shí)驗(yàn)分為對照組（不含藥物）和順鉑組（10mg·L－1），作用72h，每組設(shè)5個復(fù)孔。取細(xì)胞培養(yǎng)上清，將上清液與包被液按1∶1比例包被后4℃過液。封閉后加入 Bax、Bcl-2和caspase-3抗體（1∶500稀釋）于4℃過夜。加入二抗（1∶1 000稀釋）室溫下孵育2h，DAB顯色液室溫避光顯色。于自動酶標(biāo)儀492nm處測定A值，計算Bax/Bcl-2比值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組神經(jīng)球生長抑制率以（±s）%表示，Bcl-2、Bax 和 caspase-3 蛋 白 分 泌 水 平 以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 各組神經(jīng)球生長抑制率 10mg·L－1順鉑作用SHG-44神經(jīng)球24、48和72h，均能明顯地抑制神經(jīng)球細(xì)胞的生長。與對照組比較，24、48和72h時順鉑組神經(jīng)球的生長均受抑制，生長抑制率差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），以72h時順鉑組神經(jīng)球的生長受抑制最為明顯。見表1。

表1 各組SHG-44神經(jīng)球的生長抑制率Tab.1 Inhibitory rates of SHG-44neuroshperes in various groups [η/（±s）%]

表1 各組SHG-44神經(jīng)球的生長抑制率Tab.1 Inhibitory rates of SHG-44neuroshperes in various groups [η/（±s）%]

＊ P＜0.01compared with control group.

Group Inhibitoryrate（t/h）24 48 72 Control 0.00±0.02 0.00±0.01 0.00±0.02 Cisplatin 15.51±2.82＊ 11.36±3.80＊ 21.38±3.66＊

2.2 神經(jīng)球凋亡形態(tài)學(xué) 倒置顯微鏡下觀察，在10mg·L－1順鉑作用24、48和72h時神經(jīng)球數(shù)量減少，每個時間段神經(jīng)球均可見明顯的凋亡小體，并隨著時間的延長，SHG-44神經(jīng)球凋亡的細(xì)胞越來越多，尤其以72h時最為明顯。見圖1。

2.3 神經(jīng)球分泌 Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白水平 10mg·L－1順鉑作用SHG-44神經(jīng)球72h后，神經(jīng)球分泌Bax和Bcl-2水平均減少，但以Bcl－2減少尤其明顯；與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。Bax/Bcl-2比值明顯升高，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。順鉑組神經(jīng)球caspase-3分泌量增多，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

圖1 SHG-44神經(jīng)球凋亡形態(tài)學(xué)（×200）Fig.1 Morphology of apoptosis of SHG-44neurospheres（×200）

表2 SHG-44神經(jīng)球分泌 Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白水平Tab.2 Levels of Bax，Bcl-2，and caspase-3proteins secreted by SHG-44neuroshperes （±s）

表2 SHG-44神經(jīng)球分泌 Bax、Bcl-2和caspase-3蛋白水平Tab.2 Levels of Bax，Bcl-2，and caspase-3proteins secreted by SHG-44neuroshperes （±s）

＊ P＜0.05，＊＊ P＜0.01compared with control group.

ase-3 Control 0.69±0.05 0.53±0.02 1.31±0.24 0.53±Group Bax Bcl-2 Bax/Bcl-2 casp 0.02 Cisplatin 0.58±0.03 0.31±0.04＊ 1.86±0.21＊＊ 0.72±0.04＊

3 討 論

近年來，惡性腫瘤發(fā)病率呈現(xiàn)逐年攀升的趨勢，在腦腫瘤中以惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)病率升高最為明顯[5]。這種高惡性的腫瘤給人們的生命健康帶來了極大的威脅，給患者及其家庭帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。研究[6－7]表明：包括膠質(zhì)瘤在內(nèi)的惡性腦腫瘤的生長和更新是由腦腫瘤中存在BTSCs所引起，大量的證據(jù)[6－7]證實(shí)：BTSCs是腦腫瘤發(fā)生、復(fù)發(fā)的根源，也使腫瘤對放化療抵抗。因此，對腦腫瘤的研究開始集中到對BTSCs的研究方面。

神經(jīng)球懸浮培養(yǎng)法是1992年由Reynolds和Weiss[9]建立起來的，最初用來分離神經(jīng)干細(xì)胞，在神經(jīng)球中的細(xì)胞僅有10%～50%的細(xì)胞具有干細(xì)胞特性，其他細(xì)胞會繼續(xù)分化；在SCM中，干細(xì)胞、祖細(xì)胞和終末分化細(xì)胞形成了神經(jīng)球，分化細(xì)胞會在傳代時迅速死亡，干細(xì)胞則繼續(xù)增殖再形成神經(jīng)球，這個過程多次重復(fù)后培養(yǎng)體系中就存在大量、穩(wěn)定的干細(xì)胞。之后這一方法也用于BTSCs的研究中[10－11]。本課題組采用該方法培養(yǎng)出具有BTSCs特性的神經(jīng)球[12]，研究常用化療藥物順鉑對神經(jīng)球凋亡的誘導(dǎo)作用及其機(jī)制。

本研究結(jié)果顯示：10mg·L－1順鉑作用SHG-44神經(jīng)球24、48和72h時能明顯地抑制神經(jīng)球的生長，各時間段對神經(jīng)球的生長抑制率均高于對照組；順鉑作用72h時，神經(jīng)球的生長抑制率升高最為明顯。10mg·L－1順鉑作用SHG-44神經(jīng)球24、48和72h時，倒置顯微鏡下見到神經(jīng)球數(shù)量明顯減少，各組均可見到明顯的凋亡小體，并隨著時間的延長，凋亡細(xì)胞逐漸增多，以72h最為明顯。說明10mg·L－1順鉑在不同時間時均可以抑制神經(jīng)球的生長，鏡下觀察顯示：神經(jīng)球生長受抑制是由于順鉑誘導(dǎo)神經(jīng)球發(fā)生凋亡，引起神經(jīng)球數(shù)量減少所致。

可以通過多種方式誘導(dǎo)凋亡發(fā)生，但線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑在凋亡的發(fā)生中始終起到非常重要的作用。線粒體凋亡路徑中的Bcl-2家族成員一直處于凋亡研究的熱點(diǎn)[13]，研究[14－15]表明：在線粒體上，Bcl-2等抗凋亡蛋白阻斷了Bax等的促凋亡作用，當(dāng)Bcl-2表達(dá)水平減少就會降低這種阻遏作用，使Bax等激活進(jìn)而克服抗凋亡蛋白Bcl-2的作用，改變線粒體膜的生物學(xué)特性，促使某些線粒體蛋白的釋放[12]，引起凋亡發(fā)生。在本研究中，10mg·L－1順鉑作用SHG-44神經(jīng)球72h后，順鉑組Bax/Bcl-2比值明顯高于對照組。說明Bax/Bcl-2比值升高使促凋亡因素占據(jù)優(yōu)勢，因而促使神經(jīng)球凋亡發(fā)生。但具體凋亡的機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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