李菁菁，劉明博，侯雨菲，徐 珊，孔德娟，梁 冰，賀夢(mèng)子，梁 楠，馬淑梅，劉曉冬

（吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 衛(wèi)生部放射生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長(zhǎng)春 130021）

自噬是通過(guò)降解細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器和長(zhǎng)壽命蛋白來(lái)實(shí)現(xiàn)氨基酸重復(fù)利用和能量循環(huán)的一種高度保守的細(xì)胞程序[1－2]。目前研究結(jié)果顯示：自噬可產(chǎn)生兩種截然相反的結(jié)局，誘導(dǎo)適應(yīng)性反應(yīng)從而促細(xì)胞生存或誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生死亡，即自噬性細(xì)胞死亡。有文獻(xiàn)[3]報(bào)道：黃連素聯(lián)合單次照射可以通過(guò)促進(jìn)A549細(xì)胞株自噬泡的產(chǎn)生，增強(qiáng)射線(xiàn)的殺傷效應(yīng)，提示自噬可能在肺癌細(xì)胞的死亡過(guò)程中起關(guān)鍵作用。PI3KⅢ/Beclin1是自噬的主要信號(hào)調(diào)節(jié)通路，在自噬發(fā)生[4]和腫瘤抑制[5]過(guò)程中起重要作用。Beclin1和MAPLC3是編碼自噬相關(guān)蛋白的重要基因。Beclin1是構(gòu)成PI3KⅢ信號(hào)通路所必須的蛋白，敲除Beclin1會(huì)抑制自噬，從而使細(xì)胞在營(yíng)養(yǎng)缺乏情況下更易死亡。有關(guān)不同分割方案及化療藥物協(xié)同增敏作用對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷以及對(duì)自噬的影響尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究結(jié)合體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)，通過(guò)建立小鼠的肺癌異位移植腫瘤模型，探討自噬在不同照射方案和聯(lián)合化療治療腫瘤中發(fā)揮的作用及可能機(jī)制，為尋求新的腫瘤治療方案提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞 40只C57BL/6小鼠，雄性，6～7周齡，體質(zhì)量18～22g，購(gòu)自中科院北京實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物合格證號(hào)：10-1023。飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物室內(nèi)。肺癌細(xì)胞株A549和Lewis由本實(shí)驗(yàn)室保存。使用RPMI 1640培養(yǎng)基（含10%FBS、青霉素和鏈霉素各100U·mL－1），置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代。Lewis肺癌細(xì)胞長(zhǎng)至80%后，消化離心，用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的腫瘤接種。

1.2 照射條件 國(guó)產(chǎn)XSZ-220/20固定式X射線(xiàn)

深

部治療機(jī)，電壓180kV，電流18mA，濾板0.25Cu；單次靶皮距60cm，吸收劑量率為0.41Gy·min－1。A549細(xì)胞體外照射吸收劑量分別為0、2、4和6Gy。

1.3 動(dòng)物分組及處理 將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、常規(guī)分割照射組、超分割照射組和聯(lián)合組，每組10只。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Lewis肺癌細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×106mL－1于小鼠右后肢皮下接種0.2mL，待腫瘤長(zhǎng)至合適大小，給予以下處理。常規(guī)分割照射組（2Gy×5）：給予小鼠照射2Gy/次，每天1次，共5d，總劑量為10Gy；超分割照射組（1Gy×2×5）：給予小鼠照射1Gy/次，每天2次，間隔4h，共5d，總劑量為10Gy；聯(lián)合組（2Gy×5＋順鉑）：給予小鼠照射2Gy/次，每天1次，共5d，總劑量為10Gy，僅第1次照射前給予小鼠腹腔注射順鉑（3mg·kg－1）。對(duì)照組小鼠不給予照射和順鉑處理。采用游標(biāo)卡尺每天測(cè)量各組小鼠腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，監(jiān)測(cè)腫瘤體積變化。

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 以4 000個(gè)/孔A549細(xì)胞接種于96孔板。順鉑藥物濃度分別為0（對(duì)照組）、1.0、2.5、5.0、10.0、20.0 和40.0μmol·L－1，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔，藥物作用48h后檢測(cè)各組細(xì)胞存活率。選擇490nm波長(zhǎng)，酶標(biāo)儀測(cè)定各孔吸光度（A）值，細(xì)胞存活率＝實(shí)驗(yàn)組A值/對(duì)照組A值×100%，設(shè)對(duì)照組細(xì)胞存活率為1。

1.5 Western blotting法檢測(cè)自噬相關(guān)基因MAPLC3和Beclin1蛋白的表達(dá) 提取MAPLC3和Beclin1蛋白，收集A549細(xì)胞，加入適量裂解液，于4℃、離心半徑為5.8cm，12 000r·min－1

離心15min。收集上清，定量，經(jīng)100℃變性5min分裝于－80℃冰箱保存。電泳條件：濃縮膠電壓80V，分離膠電壓120V；轉(zhuǎn)膜條件（濕轉(zhuǎn)）：100V、90min；5%脫脂牛奶封閉1.5h，一抗作用4℃過(guò)夜，Tris-HCl緩沖鹽溶液（TBS）清洗NC膜3次，每次10min；二抗室溫作用1h，1×TBS清洗NC膜3次，每次10min；化學(xué)發(fā)光檢測(cè)（ECL）發(fā)光壓片顯色。以GAPDH為內(nèi)參照。蛋白檢測(cè)結(jié)果采用Quantity One軟件進(jìn)行電泳條帶灰度分析。

1.6 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)自噬相關(guān)基因的表達(dá)

取小鼠腫瘤，固定、切片、常規(guī)脫蠟水化后，過(guò)氧化酶阻斷劑、兔抗鼠PI3KⅢ、Beclin1、LC3Ⅱ抗體和DAB顯色均按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。400倍光鏡下取切片中陽(yáng)性細(xì)胞較多處的5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算各組均值。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。各組細(xì)胞存活率、荷瘤鼠腫瘤體積、腫瘤組織內(nèi)MPLC3Ⅱ、PI3KⅢ和Beclin1蛋白表達(dá)水平以±s表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 各組細(xì)胞存活率 MTT方法檢測(cè)A549細(xì)胞

對(duì)順鉑的藥物敏感性，以5.0μmol·L－1順鉑為臨界，隨著順鉑藥物濃度的增加，細(xì)胞存活率明顯下降。見(jiàn)表1。

表1 各組A549細(xì)胞存活率Tab.1 Cell viability of A549cells in various groups[n＝3，η/（±s）%]

表1 各組A549細(xì)胞存活率Tab.1 Cell viability of A549cells in various groups[n＝3，η/（±s）%]

＊ P＜0.05 vs control group.

Group Cell viabilit y 100.0±6.0 Cisplatin（μmol·L－1）1.0 95.0±5.0 2.5 98.0±4.0 5.0 87.0±5.0 10.0 45.0±4.0＊20.0 28.0±1.0＊40.0 33.0±1.0 Control（0μmol·L－1）＊

2.2 各組細(xì)胞MAPLC3和Beclin1蛋白的表達(dá)量Western blotting方法檢測(cè)不同處理組細(xì)胞自噬相關(guān)基因MAPLC3和Beclin1蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組比較，超分割照射組、常規(guī)分割照射組和聯(lián)合組小鼠MAPLC3蛋白表達(dá)水平明顯升高，分別增高1.34、2.76和1.59倍，而B(niǎo)eclin1表達(dá)分別增高2.26、1.50和1.60倍。見(jiàn)圖1。

圖1 各組細(xì)胞MAPLC3和Beclin1蛋白的表達(dá)電泳圖Fig.1 Electrophogram of expressions of MAPLC3and Beclin1protein of cells in various groups

2.3 各組荷瘤鼠移植瘤體積 第6天殺鼠取出腫瘤，檢測(cè)瘤體大?。撼指钫丈浣M小鼠腫瘤體積＜聯(lián)合組小鼠腫瘤體積＜常規(guī)分割照射組小鼠腫瘤體積＜對(duì)照組小鼠腫瘤體積。與對(duì)照組比較，其他各組小鼠腫瘤體積均明顯減小（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠腫瘤體積Tab.2 Tumor volumes of mice in various groups（n＝10，±s，V/cm3）

表2 各組小鼠腫瘤體積Tab.2 Tumor volumes of mice in various groups（n＝10，±s，V/cm3）

＊ P＜0.05 vs control group.

Group Tumor volume Control 2.07±0.43 Hyperfractionated radiation 1.21±0.39＊Conventional fractionated radiation 1.34±0.14＊Combination 0.74±0.01＊

2.4 各組小鼠肺癌移植瘤中MAPLC3Ⅱ、PI3KⅢ和Beclin1蛋白的表達(dá) 免疫組織化學(xué)染色，聯(lián)合組小鼠MAPLC3Ⅱ表達(dá)水平較對(duì)照組明顯增加（F＝34.04，P＜0.001），細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量棕褐色顆粒沉積。其他組小鼠MAPLC3Ⅱ表達(dá)水平較對(duì)照組也有明顯增加（P＜0.05）。聯(lián)合組小鼠PI3KⅢ和Beclin1的表達(dá)水平與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F＝19.79，P＜0.001；F＝3.509，P＜0.05），而常規(guī)分割照射組與超分割照射組間比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)圖2（插頁(yè)一）和表3。

表3 各組小鼠肺癌異位移植瘤組織中MAPLC3Ⅱ、PI3KⅢ和Beclin1蛋白的表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of MAPLC3Ⅱ，PI3KⅢ，and Beclin1protein in lung exograft tissue of mice in various groups（n＝10，±s）

表3 各組小鼠肺癌異位移植瘤組織中MAPLC3Ⅱ、PI3KⅢ和Beclin1蛋白的表達(dá)水平Tab.3 Expression levels of MAPLC3Ⅱ，PI3KⅢ，and Beclin1protein in lung exograft tissue of mice in various groups（n＝10，±s）

＊ P＜0.05 vs control group.

Group No.of positive cells MAP LC3Ⅱ PI3KⅢBeclin1 Control 84.01±5.57 27.33±2.02 19.67±1.14 Hyperfractionated radiation 271.11±12.77＊ 196.03±13.01＊ 33.67±1.81＊Conventional fractionated radiation 275.33±14.29＊ 216.67±12.51＊ 43.33±2.57＊Combination 350.02±18.00＊ 472.67±10.06＊ 68.67±5.89＊

3 討 論

目前，自噬已成為腫瘤研究中重要的領(lǐng)域之一。自噬的缺失可以影響細(xì)胞的增殖、衰老和癌變等多種病理生理過(guò)程。同時(shí)在許多抗腫瘤的治療方法中可見(jiàn)誘導(dǎo)的自噬的發(fā)生[6－7]。輻射導(dǎo)致 DNA雙鏈斷裂誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡被認(rèn)為是殺傷腫瘤細(xì)胞的主要方式，但有研究[8]表明：在許多癌細(xì)胞中，輻射可以不依賴(lài)于凋亡而誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡的發(fā)生。

常規(guī)分割放射治療方案是臨床廣泛應(yīng)用的放射治療模式，超分割放射治療的原則是在最大化利用輻射殺傷腫瘤的效應(yīng)的基礎(chǔ)上保護(hù)病灶周?chē)＝M織。本研究選用肺癌細(xì)胞株和小鼠移植瘤模型，分別進(jìn)行總劑量為10Gy的常規(guī)分割和超分割照射方式，并采用較低劑量順鉑聯(lián)合常規(guī)分割照射，旨在觀察順鉑是否具有放療協(xié)同增敏作用，即在較低劑量時(shí)順鉑是否產(chǎn)生較大的殺傷作用，最大程度保護(hù)機(jī)體避免放化療的副作用。本研究結(jié)果證實(shí)：順鉑在離體和在體實(shí)驗(yàn)中均可以增敏常規(guī)放療產(chǎn)生殺傷作用，抑制腫瘤生長(zhǎng)。

越來(lái)越多的證據(jù)[9－10]表明：自噬在腫瘤治療中發(fā)揮很大作用，通過(guò)調(diào)控自噬的水平可以改變細(xì)胞對(duì)放化療的敏感性，如HMGB1通過(guò)誘導(dǎo)自噬促進(jìn)白血病和骨肉瘤細(xì)胞的耐藥性。因此本研究進(jìn)一步檢測(cè)了自噬在順鉑協(xié)同放療敏感性中的作用。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)：無(wú)論是離體實(shí)驗(yàn)還是在體實(shí)驗(yàn)中，PI3KⅢ/Beclin1這一信號(hào)通路和自噬標(biāo)志性分子MAPLC3Ⅱ的表達(dá)在處理后出現(xiàn)不同程度增加，尤其聯(lián)合組的蛋白表達(dá)水平明顯高于其他各組。PI3KⅢ/Beclin1是調(diào)控自噬的主要通路之一，對(duì)Beclin1的深入研究使自噬對(duì)腫瘤具有重要作用的觀點(diǎn)被首次承認(rèn)[11－12]。在 H460肺癌細(xì)胞的研究中，沉默Beclin1基因誘導(dǎo)了細(xì)胞輻射抗性的產(chǎn)生[13]。免疫共沉淀研究顯示：PI3KⅢ是Beclin1主要的結(jié)合蛋白，兩者形成的復(fù)合物參與細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、惡變和腫瘤的發(fā)生發(fā)展等多種生物學(xué)過(guò)程。Wang等[14]研究發(fā)現(xiàn)：Akt通過(guò)調(diào)控Beclin1的磷酸化來(lái)調(diào)控自噬和腫瘤形成。本研究結(jié)果表明：小劑量順鉑聯(lián)合放療可能通過(guò)促進(jìn)自噬的發(fā)生來(lái)達(dá)到殺傷腫瘤細(xì)胞的作用。

在肺癌的治療過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞對(duì)輻射和藥物的抵抗是影響治療效果的主要因素[15－17]。本研究結(jié)果揭示了自噬在放療和順鉑治療非小細(xì)胞肺癌中的作用，提高自噬的發(fā)生可以作為增加細(xì)胞的輻射敏感性一個(gè)重要目標(biāo)。

[1]Klionsky DJ. The molecular machinery of autophagy：unanswered questions[J].J Cell Sci，2005，118（Pt 1）：7-18.

[2]Bursch W.The autophagosomal-lysosomal compartment in programmed cell death [J].Cell Death Differ，2001，8（6）：569-581.

[3]Peng PL，Kuo WH，Tseng HC，et al.Synergistic tumorkilling effect of radiation and berberine combined treatment in lung cancer：the contribution of autophagic cell death[J].Int J Radiat Oncol Biol Phys，2008，70（2）：529-542.

[4]Choi AM，Ryter SW，Levine B.Autophagy in human health and disease[J].N Engl J Med，2013，368（19）：1845-1846.

[5]Li X，Yan J，Wang L，et al.Beclin1inhibition promotes autophagy and decreases gemcitabine-induced apoptosis in Miapaca2pancreatic cancer cells[J].Cancer Cell Int，2013，13（1）：26.

[6]Sheng Y，Sun B，Guo WT，et al.3-Methyladenine induces cell death and its interaction with chemotherapeutic drugs is independent of autophagy [J].Biochem Biophys Res Commun，2013，432（1）：5-9.

[7]Shabaik YH，Millard M，Neamati N.Mechanistic evaluation of a novel small molecule targeting mitochondria in pancreatic cancer cells[J].PLoS One，2013，8（1）：e54346.

[8]Yi H，Liang B，Jia J，et al.Differential roles of miR-199a-5p in radiation-induced autophagy in breast cancer cells [J].FEBS Lett，2013，587（5）：436-443.

[9]Liu L，Yang M，Kang R，et al.HMGB1-induced autophagy promotes chemotherapy resistance in leukemia cells [J].Leukemia，2011，25（1）：23-31.

[10]Huang J，Ni JD，Liu K，et al.HMGB1promotes drug resistance in osteosarcoma [J].Cancer Res，2012，72（1）：230-238.

[11]Frémont S，Gérard A， Galloux M，et al.Beclin-1is required for chromosome congression and proper outer kinetochore assembly[J].EMBO Rep，2013，14（4）：364-372.

[12]Ricci A，Cherubini E，Scozzi D，et al.Decreased expression of autophagic beclin 1protein in idiopathic pulmonary fibrosis fibroblasts [J].J Cell Physiol，2013，228（7）：1516-1524.

[13]Kim KW， Hwang M， Moretti L，et al. Autophagy upregulation by inhibitors of caspase-3and mTOR enhances radiotherapy in a mouse model of lung cancer [J].Autophagy，2008，4（5）：659-668.

[14]Wang RC，Wei YJ，An ZY，et al.Akt-mediated regulation of autophagy and tumorigenesis through beclin 1 phosphorylation [J].Science，2012，338（6109）：956-959.

[15]Willers H， Azzoli CG， Santivasi WL， et al. Basic mechanisms of therapeutic resistance to radiation and chemotherapy in lung cancer [J].Cancer J，2013，19（3）：200-207.

[16]陳天君，高 飛，孫忠民，等.依托泊苷聯(lián)合洛鉑或順鉑治療廣泛期小細(xì)胞肺癌的對(duì)照研究 [J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，34（2）：198-201，209.

[17]楊曉利，王 峰，何 煒，等.貝伐單抗聯(lián)合培美曲塞加順鉑一線(xiàn)治療Ⅳ期非小細(xì)胞肺癌的臨床觀察 [J].西安交通大學(xué)學(xué)報(bào)：醫(yī)學(xué)版，2013，34（4）：554-556.