孟祥科，孫陽，屈菲，姜志強，毛明光，李艷秋，吳洪

(1.大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023;2.遼寧出入境檢驗檢疫局通關(guān)處，遼寧大連116001)

近年來，隨著魚粉價格的升高，用植物性蛋白作為魚粉的替代品得到廣泛關(guān)注［1-2］，但是植物蛋白中存在的多種抗營養(yǎng)因子嚴重阻礙了水產(chǎn)動物對于營養(yǎng)物質(zhì)的有效利用［3］。植酸廣泛存在于植物性原料中，是一種抗營養(yǎng)因子，它能夠無選擇性地螯合蛋白，抑制一些酶的活力包括蛋白酶、胰蛋白酶和α-淀粉酶等。魚類養(yǎng)殖試驗已證明［4-7］，植酸能夠降低磷的利用率，影響魚類的生長、體組成和飼料效率。植酸在大多數(shù)加工過程中不容易被去除，而添加植酸酶可以水解飼料中的植酸和植酸鹽，促進動物對磷的吸收，減少磷排放，改善動物生長性能。

近年來，隨著畜禽動物飼料中植酸酶應用研究的逐漸深入，水產(chǎn)動物飼料中添加植酸酶的研究報道也相繼增加。研究表明，飼料中添加植酸酶能顯著改善點帶石斑魚［4］、真鯛［5］、大西洋鮭［6］等魚類的生長及飼料效率，但飼料中添加植酸酶對紅鰭東方鲀Takifugu rubripes生長性能及飼料利用等的研究目前卻鮮見報道。紅鰭東方鲀營養(yǎng)豐富、肉味鮮美，是一種名貴的海水魚類。本研究中，以紅鰭東方鲀幼魚為試驗對象，在以添加豆粕降低魚粉用量的基礎上添加不同水平的植酸酶，研究植酸酶對東方鲀幼魚生長、消化酶及消化率的影響，以期為植酸酶在紅鰭東方鲀飼料中的合理利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用紅鰭東方鲀幼魚購自大連富谷水產(chǎn)有限公司。試驗用植酸酶購自山東濰坊蘇柯漢生物工程有限公司 (酶活力為5 000 U/g)。試驗共制作6組飼料。對照組D1，全魚粉蛋白組;對照組D2，以豆粕替代30%魚粉蛋白組;試驗組S1～S4，在豆粕替代30%魚粉蛋白基礎上設4個不同的植酸酶添加水平 (500、1 000、1 500、2 000 U/kg)。植酸酶活性定義為:在37℃、pH為5.5反應條件下，從5.0 mmol/L植酸鈉溶液中每分鐘釋放1 μmol/L無機正磷酸根所需植酸酶的量為1個酶活力單位 (U)。

主要原料經(jīng)粉碎研磨后過80目網(wǎng)篩，混合均勻后用制粒機擠壓成軟顆粒飼料，飼料規(guī)格隨魚的生長階段而定。飼料分批制作:試驗初期飼料粒徑為1 mm;待幼魚平均體質(zhì)量為10～20 g時調(diào)整粒徑為2 mm;幼魚平均體質(zhì)量大于20 g后再調(diào)整粒徑為3 mm。制成的飼料于冰箱 (-20℃)中保存?zhèn)溆?。試驗飼料的組成及營養(yǎng)成分見表1。

表1 試驗飼料營養(yǎng)成分Tab.1 The ingredients and appromimate composition of the experimental diets(dry matter)

1.2 方法

1.2.1 飼養(yǎng)管理 試驗幼魚先暫養(yǎng)20 d，期間投喂魚糜，之后投喂基礎飼料馴養(yǎng)10 d，待幼魚完全適應養(yǎng)殖環(huán)境后開始正式試驗。試驗設6組，每組設3個重復，在18個200 L藍色方形水槽中，分別投放初始體質(zhì)量為 (4.58±0.05)g的幼魚20尾。每天8:00和16:00投喂。投喂量以接近飽食為準。投飼半小時后吸底清除殘餌。飼養(yǎng)期間采用流水養(yǎng)殖，水流流速約為3 L/min，24 h微充氣。

試驗在大連海洋大學農(nóng)業(yè)部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室進行，飼養(yǎng)期為60 d。養(yǎng)殖期間水溫為20～24℃，溶解氧＞5 mg/L，pH為8.0±0.1，鹽度為32.6±0.2。

1.2.2 樣品的收集 60 d飼養(yǎng)期結(jié)束后，停食24 h，從每個水槽中隨機取5尾魚，測定其體長、體質(zhì)量等，然后在冰盤上解剖，迅速剪取肝胰臟、前腸中段，并用4℃預冷生理鹽水沖洗干凈，置于超低溫冰箱 (-80℃)中保存?zhèn)溆谩?/p>

在投喂試驗飼料飼養(yǎng)20 d，試驗魚生活狀態(tài)穩(wěn)定后開始收集糞便。每次投喂后吸凈槽底殘餌，4～5 h后用虹吸法收集糞便，置于培養(yǎng)皿中于70℃下烘干，待測。糞便樣品連續(xù)收集15 d。

1.2.3 測定及計算方法

1)生長指標。試驗魚特定生長率 (SGR)、飼料系數(shù) (FCR)、蛋白質(zhì)效率 (PER)、存活率的計算公式如下:

存活率 (%)=存活尾數(shù)/總尾數(shù)×100，

其中:W0、Wt為試驗魚的初始體質(zhì)量 (g)和終末體質(zhì)量 (g);t為試驗時間 (d);C為攝餌量(g);Cp為蛋白質(zhì)攝入量 (干質(zhì)量，g)。

2)形體指標。試驗魚的肝體比 (HSI)、臟體比 (VSI)、肥滿度 (CF)計算公式如下:

HSI(%)=肝臟質(zhì)量/魚體質(zhì)量×100，

VSI(%)=內(nèi)臟質(zhì)量/魚體質(zhì)量×100，

CF=W/L3×100，

其中:W為試驗魚體質(zhì)量(g);L為試驗魚長度(cm)。

3)粗酶液的制備。將存放于-80℃下的肝胰臟和腸組織樣品在4℃下解凍，剪碎，按1 g組織加入9 mL生理鹽水的比例加入預冷的生理鹽水，在玻璃勻漿器中勻漿，粗酶液于4℃下以10 000 r/min離心10 min，取上清液備用。

用蛋白質(zhì)試劑盒 (考馬斯亮蘭法)測定組織勻漿蛋白質(zhì)含量。

采用福林-酚試劑法測定蛋白酶活力，其活性單位定義為:在37℃條件下，每分鐘水解酪素所產(chǎn)生1 μg酪氨酸為一個酶活力單位 (U)。

用脂肪酶試劑盒 (比濁法)測定脂肪酶活性，其活性單位定義為:在37℃條件下，每克組織蛋白在本反應體系中與底物反應1 min，每消耗1 μmol底物為一個酶活力單位 (U)。

4)表觀消化率。采用Cr2O3指示劑法測定消化率，飼料中指示劑摻入量為0.5%，采用濕式灰化定量法測定飼料和糞便中的Cr2O3含量。養(yǎng)分物質(zhì)消化率 (D)和飼料干物質(zhì)消化率 (D')的計算公式如下:

其中:A'和A分別為餌料和糞便中的營養(yǎng)物質(zhì)含量;B和B'分別為餌料和糞便中的Cr2O3的含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差的形式表示，采用SPSS 16.0軟件進行方差分析和Duncan多重比較，顯著性水平設為0.05。

2 結(jié)果

2.1 植酸酶對紅鰭東方鲀幼魚生長性能的影響

由表2可以看出:經(jīng)過60 d的飼養(yǎng)試驗后，各組紅鰭東方鲀幼魚成活率沒有顯著差異 (P＞0.05);相對于對照組D1，不同處理的豆粕替代30%魚粉蛋白組 (D2，S1～S4)幼魚的終末體質(zhì)量、SGR、PER等均顯著降低 (P＜0.05)，F(xiàn)CR明顯升高 (P＜0.05);相對于D2組，試驗組 (S1～S4)幼魚的生長性能整體提高，當植酸酶添加水平≥1 000 U/kg時，幼魚的終末體質(zhì)量、SGR明顯提高 (P＜0.05)，而FCR則顯著降低 (P＜0.05)。

表2 植酸酶對紅鰭東方鲀幼魚生長性能的影響Tab.2 Effects of dietary phytase on growth performance in juvenile redfin puffer Takifugu rubripes

2.2 植酸酶對紅鰭東方鲀幼魚形體指標的影響

由表3可以看出:與D1組相比，D2組幼魚HSI顯著升高 (P＜0.05);與D2組相比，添加植酸酶對紅鰭東方鲀幼魚HSI、VSI、CF均未產(chǎn)生顯著影響 (P＞0.05)。

表3 植酸酶對幼魚肝體比、臟體比及肥滿度的影響Tab.3 Effects of dietary phytase on hepato-somatic index(HSI)，viscera-somatic index(VSI)and condition factor(CF)in juvenile redfin puffer Takifugu rubripes

2.3 植酸酶對紅鰭東方鲀幼魚消化酶活力的影響

由表4可以看出:與D1組相比，豆粕替代30%魚粉蛋白后肝胰臟蛋白酶活力明顯降低 (P＜0.05)。隨植酸酶添加量的增加，幼魚肝胰臟蛋白酶活力呈增加趨勢，當植酸酶添加量為1 000、1 500、2 000 U/kg時，肝胰臟中的蛋白酶活力較D2組顯著升高 (P＜0.05)。本研究結(jié)果表明，添加植酸酶能明顯提高幼魚腸道蛋白酶活力，且植酸酶添加量為1 000、1 500 U/kg時，幼魚腸道蛋白酶活力較D2組分別提高20.33%、16.51%。

與D2組相比，添加植酸酶對各組幼魚肝胰臟脂肪酶活力未產(chǎn)生顯著影響 (P＞0.05);隨植酸酶的添加，幼魚腸道脂肪酶活力呈先升高后降低的趨勢，在植酸酶添加水平為1 500 U/kg時達到最高，與D1組差異不顯著(P＞0.05)，但與D2組差異顯著 (P＜0.05)。

各組幼魚腸道淀粉酶活力隨植酸酶添加量的增加呈先升高后降低的趨勢，在植酸酶添加量為500 U/kg時達到最高，與 D1組差異不顯著 (P＞0.05)，但與D2組差異顯著 (P＜0.05);添加植酸梅對幼魚肝胰臟淀粉酶活性未產(chǎn)生顯著影響(P＞0.05)。

表4 植酸酶對紅鰭東方鲀幼魚消化酶活力的影響Tab.4 Effects of dietary phytase on digestive enzyme activities in juvenile redfin puffer Takifugu rubripes U/g

2.4 植酸酶對紅鰭東方鲀幼魚消化率的影響

由表5可知:紅鰭東方鲀幼魚對干物質(zhì)及磷消化率較低，而對蛋白質(zhì)和脂肪的消化率較高。添加植酸酶對幼魚干物質(zhì)消化率未產(chǎn)生顯著影響 (P＞0.05)，但隨植酸酶添加量的增加，干物質(zhì)消化率呈升高的趨勢，且在1 000 U/kg處達到最大值;植酸酶添加量為1 000 U/kg時，蛋白質(zhì)消化率較D2組顯著提高(P＜0.05);植酸酶添加量為1 000、1 500 U/kg時，脂肪消化率較D2組顯著提高(P＜0.05);添加植酸酶后，磷消化率較D2組顯著增加(P＜0.05)，植酸酶添加水平為500、1 000、1 500、2 000 U/kg時，磷消化率較D2組分別提高 39.55%、47.60%、56.89%、46.79%。

表5 植酸酶對紅鰭東方鲀幼魚消化率的影響Tab.5 Effects of dietary phytase on digestibility in juvenile redfin puffer Takifugu rubripes %

3 討論

3.1 植酸酶水平對紅鰭東方鲀生長性能的影響

有研究資料表明［4-8］，在水產(chǎn)動物飼料中添加適量的植酸酶，可以提高其生長性能，促進其生長。植酸酶對水產(chǎn)動物的作用因試驗動物種類、植酸酶的含量以及飼料成分等的差異，研究結(jié)果各有不同。馬恒甲等［7］在低磷全植物性蛋白草魚基礎飼料中添加植酸酶的試驗結(jié)果表明，添加大于1 000 U/kg的植酸酶可以明顯提高草魚的特定增長率、蛋白轉(zhuǎn)化率，并顯著降低餌料系數(shù)。陳新宇等［8］在研究植酸酶對凡納濱對蝦生長性能的影響時發(fā)現(xiàn)，在總磷含量為1.6%，植酸磷含量為0.3%，非植酸磷含量為1.3%的基礎飼料中添加500～2 000 U/kg的植酸酶，對其增重率、飼料利用率和存活率均無顯著影響，作者分析原因，可能是其試驗基礎飼料中的磷含量已經(jīng)能滿足凡納濱對蝦正常的生長需求。本試驗結(jié)果顯示，與D2組相比，飼料中添加1 000 U/kg的植酸酶，能顯著提高紅鰭東方鲀幼魚的生長性能，證實了酸性植酸酶在紅鰭東方鲀配合飼料中應用的可行性。通過本試驗結(jié)果推測，試驗組幼魚的磷需求量要大于基礎飼料中所提供的總磷水平 (1.47%)。

幼魚消化系統(tǒng)發(fā)育不及成魚完善，可能會對各種外界因子尤其是餌料因子變化的反應較敏感［9］，尤其是肉食性魚類對餌料蛋白要求高，若飼料中植物蛋白明顯增加時，可能會對消化系統(tǒng)發(fā)育產(chǎn)生一定影響，肝體比會發(fā)生較大變化。本試驗中，D2組肝體比與D1組相比明顯增加，這與莊平等［10］和Kaushik等［11］研究豆粕替代魚粉蛋白的試驗結(jié)果一致。這可能是飼料中豆粕比例較高時，某些抗營養(yǎng)因子 (如植酸、皂苷、低聚糖類等)的存在，引起肝臟消化酶的分泌增加［12］，加重了肝臟代謝負擔，導致肝臟代償性增大。本試驗結(jié)果顯示，植酸酶對紅鰭東方鲀幼魚HSI、VSI、CF指標沒有顯著影響，但隨植酸酶添加量的增加，肝體比有一定的降低，但S1～S4組均與D1組差異不顯著，說明飼料中添加植酸酶對防止肝臟腫大，降低肝臟負荷有一定作用，但效果不明顯。

3.2 植酸酶對紅鰭東方鲀幼魚消化酶活力的影響

魚類消化酶活力受諸多因素影響，其中包括飼料組成［13］，植物性原料中的植酸對水產(chǎn)動物分泌的消化酶如淀粉水解酶、脂肪酶、蛋白水解酶等的活性均有抑制作用。添加植酸酶可以解除植酸對消化酶的抑制作用［14］，促進營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收。

紅鰭東方鲀?yōu)槿馐承贼~類，喜歡攝入蛋白質(zhì)和脂類含量較高的食物，而且極為貪食，對營養(yǎng)物質(zhì)有較高的消化和吸收能力。本試驗結(jié)果顯示，所有試驗組肝胰臟及腸道蛋白酶活力均較高，且腸道蛋白酶活力高達1 302.62～1 741.29 U/g;相比D2組，試驗組 (S1～S4)幼魚肝胰臟及腸道蛋白酶活力整體提高，表明植酸酶能提高紅鰭東方鲀幼魚肝胰臟及腸道蛋白酶活力，這與朱麗英［15］關(guān)于植酸酶對異育銀鯽生長、內(nèi)源酶的影響，姚瑞清等［16］關(guān)于植酸酶對奧尼羅非魚生長、表觀消化率與消化酶活性的影響，以及張璐等［17］關(guān)于植酸酶和非淀粉多糖酶對鱸生長和消化酶活性的影響等的研究結(jié)果相似。

呂林蘭等［18］關(guān)于植酸酶對異育銀鯽的研究結(jié)果顯示，添加1 000～1 500 U/kg的植酸酶能提高肝胰臟和腸道脂肪酶的活性。王楓［19］在對金鱒的研究中發(fā)現(xiàn)，植酸酶的添加導致金鱒腸道和肝胰臟脂肪酶活性略有降低，但差異不顯著。本試驗結(jié)果與上述研究結(jié)果不同:添加植酸酶雖然提高了紅鰭東方鲀幼魚腸道脂肪酶活力，但是未對其肝胰臟脂肪酶活力產(chǎn)生明顯影響，這可能與肝胰臟脂肪酶主要以酶源的形式儲存在肝胰臟中未被激活有關(guān)，具體原因有待進一步探究。

本試驗中，各組肝胰臟及腸道淀粉酶活力均較低，很好地反映了紅鰭東方鲀的食性特點。植酸酶添加量為500 U/kg時，腸道道淀粉酶活力達到最高，隨添加量繼續(xù)增加活力依次降低。相關(guān)研究顯示，淀粉酶活力會因食物中某些金屬離子濃度的提高而受到明顯抑制［20］。本試驗中，由于植酸酶在紅鰭東方鲀幼魚消化道內(nèi)，阻礙了植酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合，并大量釋放與植酸結(jié)合的金屬離子，導致某些金屬離子濃度過高，抑制了腸道淀粉酶活力，因此，會呈現(xiàn)腸道淀粉酶活力先升高后降低的趨勢。這與牛繼峰等［21］對大口黑鱸的研究結(jié)果一致。

3.3 植酸酶對紅鰭東方鲀幼魚消化率的影響

研究表明，當飼料中植物性蛋白質(zhì)含量過高時，會顯著降低魚類的飼料利用率［22］。本試驗結(jié)果顯示，與D1組相比，D2、S1～S4組紅鰭東方鲀幼魚生長性能及消化率明顯降低 (P＜0.05)，這與宋理平等［23］對寶石鱸及陳京華等［24］對牙鲆的研究結(jié)果相似。

植酸分子中的堿性磷酸基團能與蛋白質(zhì)中質(zhì)子化的氨基酸、金屬離子結(jié)合生成螯合物，使蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀而降低其利用率及消化酶活力，從而影響飼料的利用率。磷是魚類生長所必須的營養(yǎng)元素之一［25］，植酸酶的添加可以打開飼料中植酸的磷酸磷脂鍵釋放出無機磷，提高磷的利用率，同時消除與植酸結(jié)合的蛋白質(zhì)，有利于動物對其消化吸收。

關(guān)于植酸酶對水產(chǎn)動物消化能力的影響，已有一些報道。宋理平等［23］研究顯示，一定濃度的植酸酶可以明顯提高寶石鱸的干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪、鈣、磷的表觀消化率。舒秋艷等［26］指出，飼料中添加植酸酶可以一定程度上提高青魚粗蛋白質(zhì)、粗脂肪、粗灰分及鈣表觀消化率。本試驗結(jié)果顯示，飼料中添加植酸酶可提高紅鰭東方鲀干物質(zhì)、蛋白質(zhì)、脂肪、磷消化率，表明植酸酶對其營養(yǎng)物質(zhì)的利用有一定促進作用。因此，飼料中添加適量的植酸酶可以改善紅鰭東方鲀的營養(yǎng)利用率，降低磷排放，節(jié)約飼料成本。

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