王雪瑤，潘潤洲，魯 曦，郭姝奇，閆亞欣，李 欣

(1.承德醫(yī)學(xué)院2010級臨床本科，河北承德 067000;2.指導(dǎo)教師)

膜聯(lián)蛋白(ANXA)是一個Ca2＋依賴的磷脂結(jié)合蛋白家族，結(jié)構(gòu)上，它們都有C端保守的核心區(qū)域，N端序列中有磷脂酶A2(PLA2)和蛋白激酶C(PKC)的結(jié)合位點。功能上，在Ca2＋存在的條件下，它們可與細胞膜上的磷脂酰絲氨酸(PS)可逆性地結(jié)合。PKC是胞外細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要成分，若過度激活會造成細胞增殖失調(diào)，佛波脂(PMC)是PKC的激動劑，可持續(xù)激活PKC而引起腫瘤的發(fā)生。ANXA5由于其N端缺乏PKC結(jié)合位點而不能成為PKC的底物，同時ANXA5還是PKC的抑制劑，這注定了ANXA5與腫瘤的發(fā)生必定有著某些聯(lián)系，有研究表明，ANXA5與細胞凋亡密切相關(guān)。為了更深入地研究ANXA5在腫瘤中的作用，我們選擇宮頸癌細胞系SiHa，構(gòu)建ANXA5重組質(zhì)粒并進行轉(zhuǎn)染，對比觀察ANXA5過表達對SiHa細胞形態(tài)的影響。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 pcDNA3.1質(zhì)粒的大腸桿菌，細胞培養(yǎng)基(DMEM)，SiHa細胞，顯微鏡。

1.2 細胞培養(yǎng) SiHa細胞培養(yǎng)于含10%小牛血清和2g/LNaHCO3的DMEM中，置于37.5%CO2的孵箱中，隔天換液一次，待細胞達到對數(shù)生長期和90%密度時，取細胞進行實驗。

1.3 構(gòu)建ANXA5的重組質(zhì)粒 大量擴增含pcDNA3.1質(zhì)粒的大腸桿菌，抽質(zhì)粒后用BamHI和XhoI進行酶切，獲得帶有BamHI和XhoI酶切位點的粘性末端的空質(zhì)粒載體;設(shè)計膜聯(lián)蛋白A5的引物，正向引物含BamHI酶切位點，反向引物含XhoI酶切位點，擴增含有膜聯(lián)蛋白A5質(zhì)粒的大腸桿菌，抽質(zhì)粒后以此質(zhì)粒為模板，PCR擴增出與pcDNA3.1空質(zhì)粒帶有相同酶切位點的膜聯(lián)蛋白A5基因。用T4連接酶將pcDNA3.1空質(zhì)粒與膜聯(lián)蛋白A5基因相連，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌，涂板，挑克隆，搖菌抽質(zhì)粒后酶切鑒定含膜聯(lián)蛋白A5基因的克隆，大量擴增該克隆菌后抽質(zhì)粒，得到pcDNA3.1-ANXA5重組質(zhì)粒。

1.4 脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染細胞 用酯脂體法將pcDNA3.1-ANXA5重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宮頸癌細胞系細胞SiHa細胞，G418加壓篩選，挑取細胞克隆，繼續(xù)細胞培養(yǎng)。

1.5 對過表達ANXA5的細胞的鑒定 對于成功轉(zhuǎn)染了pcDNA3.1-ANXA5的SiHa細胞，通過western blot的方法對所挑取的細胞克隆進行鑒定，膜聯(lián)蛋白A5表達高于未轉(zhuǎn)染細胞者為陽性細胞。

1.6 倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)改變 將細胞分為空白對照細胞、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細胞和鑒定后過表達ANXA5的陽性細胞分別置于倒置顯微鏡下，觀察三組細胞的形態(tài)改變。

2 結(jié)果

轉(zhuǎn)染ANXA5的陽性細胞過表達ANXA5，轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒細胞ANXA5的表達無改變(圖1)。過表達ANXA5的細胞體積大小不一，細胞形態(tài)多樣，不規(guī)則，細胞邊界變粗糙，胞質(zhì)內(nèi)可見顆粒樣物質(zhì)(圖2)。

圖1 陽性轉(zhuǎn)染細胞ANXA5過表達的鑒定

圖2 ANXA5不同表達的細胞形態(tài)改變

3 討論

有研究顯示，將促凋亡基因轉(zhuǎn)染入腫瘤細胞后可以消滅一定數(shù)量的腫瘤細胞，但要真正達到徹底消滅腫瘤并非易事，需要搞清腫瘤發(fā)生的機理，有針對性地將腫瘤細胞的生理過程阻斷。PKC是細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中最重要的因子之一，目前，多數(shù)學(xué)者認為PKC的激活平衡紊亂理論(PKCα/β]的激活大于PKCδ的激活)是腫瘤發(fā)生的重要因素。ANXA5的特點以及它是PKC這個細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的重要因素的抑制劑，注定它與腫瘤的發(fā)生存在著某些尚不清楚的必然聯(lián)系。我們以前的研究發(fā)現(xiàn)，ANXA5在宮頸癌中的表達顯著高于正常宮頸組織，而且可能具有促進Siha細胞凋亡的作用。

為了從形態(tài)學(xué)的角度研究膜聯(lián)蛋白A5過表達對宮頸癌細胞系SiHa的影響，我們以能夠在哺乳動物體內(nèi)表達的pcDNA3.1質(zhì)粒為載體，構(gòu)建了pcDNA3.1-ANXA5重組質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染人宮頸癌細胞系SiHa細胞后。通過western blot的方法，篩選出過度表達膜聯(lián)蛋白A5的細胞，同時將空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人SiHa細胞，形成對轉(zhuǎn)染了ANXA5基因的細胞的陰性對照，避免了由于轉(zhuǎn)染過程對細胞產(chǎn)生影響;以未進行轉(zhuǎn)染的普通SiHa細胞為空白對照，排除了質(zhì)粒對細胞的影響。鏡下觀察顯示，過度表達膜聯(lián)蛋白A5的SiHa細胞失去原有形態(tài)特點，細胞邊界變粗糙，細胞體積大小不一, 胞質(zhì)內(nèi)可見顆粒樣物質(zhì),而且細胞凋亡量增加。本研究為宮頸癌初步鑒定及ANXA5在宮頸癌發(fā)生中的作用的進一步深入研究奠定了基礎(chǔ)。雖然結(jié)果表明ANXA5自身對Siha細胞形態(tài)具有顯著影響，但是至于它是如何對Siha細胞發(fā)揮作用的，作用于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中的哪個環(huán)節(jié)等，有待于進一步研究。