王曉桃，唐愛林，聶宇薇，劉 健，劉 玲

（桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院血液科，廣西桂林541001）

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種常見的惡性腫瘤，居血液系統(tǒng)惡性腫瘤第2位，其突出的臨床特點之一是骨髓瘤骨?。╩yeloma bone dsease，MBD）。MBD的臨床表現(xiàn)包括彌漫性骨質(zhì)疏松、高鈣血癥、溶骨性改變、病理性骨折、骨痛或上述幾種病變同時存在［1］。MBD發(fā)生機制的關(guān)鍵在于骨髓瘤細胞激活破骨細胞（osteoclasts，OC）的同時抑制成骨細胞（osteoblast，OB）活性。近年來，Wnt信號轉(zhuǎn)導途徑對OB分化及活性的調(diào)節(jié)是 MBD機制研究的熱點［2］。一旦瘤負荷增長到一定的水平，瘤細胞或骨髓基質(zhì)細胞會產(chǎn)生一些Wnt信號拮抗物（如分泌型Fz相關(guān)蛋白等），抑制β－鏈蛋白（β－cate－nin）及下游的信號通路［3］。分泌型Fz相關(guān)蛋白主要有骨硬化蛋白（sclerostin）和 Dickkopfs（Dkks），有文獻報道 MBD患者存在DKK－1基因過度激活［4－5］。本研究通過檢測 MM患者骨髓中sclerostin水平，探討其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2007年1月1日至2012年3月31日在本院住院治療的 MM患者及缺鐵性貧血（iron deficient anemia，IDA）患者。MM患者納入標準：符合張之南主編的《血液病的診斷和療效標準》關(guān)于 MM的診斷標準。排除標準：（1）血清膽紅素升高，丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶高于正常上限2倍，心功能2級以上，距離較大的手術(shù)28d以內(nèi)；（2）女性患者處于妊娠或哺乳期；（3）合并其他惡性腫瘤（非惡性黑色素瘤除外）；（4）合并嚴重感染或代謝性疾病。IDA患者納入標準：符合張之南主編的《血液病的診斷和療效標準》關(guān)于IDA的診斷標準，剔除經(jīng)過治療的患者，入選前均征得患者及家屬的同意。納入研究的MM患者中男29例，女24例；年齡48～74歲，中位年齡65歲；其中33例為初診患者，20例為復發(fā)患者；免疫分型中IgG型18例，IgA型12例，IgD型4例，輕鏈型19例。臨床ISS分期Ⅱ期19例，Ⅲ期34例。采用門診、電話及通信方法對患者進行隨訪，隨訪時間為6～65個月，平均隨訪時間為（34.1±18.6）個月。以同期住院的30例IDA患者為對照組，其中男14例，女16例；年齡15～58歲，中位年齡46歲。上述兩組患者年齡及性別基線資料有可比性。所有MM患者均進行X線檢查：包括顱骨、頸椎、胸椎、腰椎、肋骨、肱骨、股骨及骨盆，以確定有無溶骨病變或骨質(zhì)疏松；對X線檢查陰性者，還將進行MRI或CT檢查。血清校正鈣濃度＝（40－清蛋白）×0.02＋血清鈣。以X線檢查為標準，參考文獻［6］將BMD分為1級（普遍的骨質(zhì)疏松）4例（7.55%），2級（骨質(zhì)破壞在2處以下）21例（39.62%），3級（骨質(zhì)破壞大于或等于2處、壓縮性骨折或病理性骨折）28例（52.83%）。

1.2 儀器與試劑 sclerostin酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒（美國R＆D公司），Trizol試劑（Invitroge公司），sclerostin逆轉(zhuǎn)錄－聚合酶鏈反應（RT－PCR）試劑盒（上海微晶生物制品有限公司）。sclerostin上游引物5′－TCC CCA CCA CCC CTT TG－3′，下游引物5′－GGT CA CGT AGC GGG TGA A－3′，片段長度76bp，內(nèi)參照為3－磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH），上游引物5′－ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC－3′，下 游 引 物 5′－TCC ACC ACC CTG TTG CTG－3′，片段長度486bp。自動酶標讀數(shù)儀（國產(chǎn)DG－3022）；Fluor ChemTM8900凝膠成像系統(tǒng)（美國Alpha Innotech公司）。

1.3 標本采集 取骨髓5mL，經(jīng)肝素抗凝處理后，緩慢加入已裝有5mL淋巴細胞分離液的離心管中，2 000r／min離心30min，留取上清液以備用；同時提取中間單核細胞（BMMNC）置于另一干燥離心管中以備用。

1.4 方法

1.4.1 ELISA 定量檢測標本sclerostin含量，實驗步驟嚴格按照試劑盒說明書進行，實驗重復3次，取均值。

1.4.2 RT－PCR 檢測骨髓BMMNC sclerostin的表達：（1）提取骨髓液BMMNC；（2）Trizol一步法提取細胞總RNA；（3）反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；（4）進行PCR擴增。PCR反應總體積為25 μL，94℃變性2min并激活Taq酶，其后94℃變性40s，退火1min（GAPDH 56 ℃，sclerostin 60 ℃），72 ℃ 延 伸1min，GAPDH、sclerostin分別為35、40個循環(huán)，最后72℃補齊5 min。取5μL的PCR擴增產(chǎn)物在2%瓊脂糖凝膠上電泳鑒定，0.5μg／mL EB染色10min，然后在紫外檢測儀上觀察，用Fluor ChemTM8900凝膠成像系統(tǒng)進行分析。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以±s表示，等級資料用中位數(shù)（最小值，最大值）表示，兩參數(shù)比較采用t檢驗，兩因素相關(guān)采用簡單相關(guān)及等級相關(guān)（Spearman）分析，生存分析采用 Kaplan－Meier法并用log－rank檢驗，檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 MM組與對照組骨髓上清液中sclerostin水平 sclerostin水平高于對照組x±2s為顯著增高，MM組中有27例（51.9%）增高，其骨髓上清液中sclerostin的水平（0.54±0.21）pg／mL明顯高于對照組（0.31±0.06）pg／mL（t＝5.67，P＝0.00）。在MM組中，復發(fā)難治的MM患者骨髓sclerostin水平（0.65±0.17）pg／mL明顯高于對照組及初診的 MM患者（0.47±0.21）pg／mL（t＝8.44、3.27，P＜0.01）。本研究用RT－PCR進一步驗證大部分 MM患者骨髓BMMNC分泌sclerostin，且有骨質(zhì)破壞的患者明顯高于無骨質(zhì)破壞的患者（圖1）。

圖1 對照組及部分MM患者BMMNC中sclerostin的表達

2.2 sclerostin的水平與臨床參數(shù)的相關(guān)性分析 根據(jù)Greipp提供的MM預后相關(guān)參數(shù)，用Pearson相關(guān)分析方法分析β2－微球蛋白（β2－microglobulin，β2－MG）、肌酐（serum creatinine，Scr）、年齡（age）、血小板（platelet，PLT）、乳酸脫氫酶（lactic dehydrogenase，LDH）、血紅蛋白（haemoglobin，Hb）、血清清蛋白（seralbumin，Alb）、堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、M蛋白的比例（輕鏈型、IgD和IgE型除外）、校正血鈣與sclerostin的相關(guān)性；用Spearman相關(guān)方法分析sclerostin與骨病分級及臨床ISS分期的相關(guān)性。結(jié)果顯示β2－MG、校正血鈣、ALP、M蛋白的比例、骨質(zhì)損害評分和ISS分期與sclerostin均顯著相關(guān)（P≤0.05），見表1。

表1 sclerostin與MM患者主要臨床指標的相關(guān)性（±s）

表1 sclerostin與MM患者主要臨床指標的相關(guān)性（±s）

63.04±6.29 0.142 0.309 β2－MG（g／L） 5.98±2.26 0.704 0.000 Scr（μmol／L） 171.65±117.57 0.236 0.088 LDH（U／L） 309.03±115.57 0.259 0.061 ALB（g／L） 31.34±4.57 －0.108 0.440 ALP（U／L） 44.20±22.26 －0.379 0.005 PLT（109／L） 94.85±65.87 －0.250 0.071 Hb（g／L） 64.12±10.51 －0.256 0.064校正血鈣（mmol／L） 2.50±0.45 0.369 0.007 M蛋白的比例（%） 0.38±0.15 0.312 0.023 MBD 2（1，3） 0.410 0.002 ISS 3（1，3）r P年齡（歲）項目±s或 M（min，max）0.486 0.000

2.3 sclerostin對患者中位生存期的影響 本研究中位隨訪時間29（6～65）個月，其中總體生存期大于或等于5年者3例（5.56%），大于或等于3年者21例（39.62%），大于或等于1年者48例（90.57%）。死亡15例（28.30%），1～3年內(nèi)死亡10例，3～5年內(nèi)死亡2例，5年以上死亡3例。4例死于復發(fā)或骨髓瘤未緩解；1例轉(zhuǎn)為漿細胞白血??；2例死于心腦血管疾??；2例死于腎衰竭；6例死于化療后骨髓抑制的嚴重并發(fā)癥如重癥感染、出血。根據(jù)對照組的sclerostin水平，將sclerostin≤0.43pg／mL定為低sclerostin組，高于0.43pg／mL定為高sclerostin組。在低sclerostin組中，19例患者在隨訪期間共14例生存，中位生存期為48（6～65）個月，95%CI 33.24～62.76；高sclerostin組中，34例患者在隨訪期間共24例生存，中位生存期為24（6～52）個月，95%CI15.43～32.57。經(jīng)Kaplan－Meier生存曲線分析兩組中位生存期，差異有統(tǒng)計學意義（χ2＝12.74，P＜0.01）。

3 討 論

sclerostin是SOST基因的表達產(chǎn)物，是一種含胱氨酸結(jié)構(gòu)的分泌型糖蛋白，是骨細胞分泌的成骨細胞的負調(diào)控因子，參與調(diào)節(jié)骨形成，決定骨重建過程中的骨量和結(jié)構(gòu)［7］。目前國內(nèi)關(guān)于sclerostin的研究主要集中在骨質(zhì)疏松領(lǐng)域中，在骨髓瘤或其他惡性腫瘤導致的骨質(zhì)破壞中少見報道，國外學者發(fā)現(xiàn)MM患者外周血sclerostin水平較健康人高，其骨質(zhì)破壞嚴重的患者顯著高于骨質(zhì)破壞不明顯、意義未明的單克隆球蛋白增多癥的患者［8］。這暗示sclerostin在 MBD的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用。本研究以骨髓為樣本，研究sclerostin在MM患者骨髓中的表達及臨床意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，MM患者骨髓上清液中的sclerostin水平高于對照組，且復發(fā)難治的MM患者明顯高于初診患者及對照組。這說明MM患者骨髓細胞可能表達sclerostin，本研究還從分子水平進一步證實大部分MM患者表達sclerostin，有骨質(zhì)破壞的患者表達陽性強于無骨質(zhì)破壞的患者，且骨質(zhì)破壞越明顯，其sclerostin的表達陽性越明顯。但表達sclerostin的BMMNC是骨髓瘤細胞還是骨髓基質(zhì)細胞則有待進一步研究。復發(fā)難治的MM患者對化療藥物不敏感，瘤負荷高，瘤細胞與骨髓基質(zhì)細胞黏附后分泌多種炎癥因子導致瘤細胞或骨髓基質(zhì)細胞持續(xù)表達更多的sclerostin。

本研究發(fā)現(xiàn)sclerostin與β2－MG、Ca2＋、ALP、M 蛋白的比例、骨質(zhì)損害評分和ISS分期均相關(guān)。ALP主要是由成骨細胞產(chǎn)生，ALP與sclerostin呈負相關(guān)，這與Brunetti等［8］的研究一致，說明sclerostin可能會抑制成骨細胞的活性，其機制可能是sclerostin阻止Wnt蛋白結(jié)合于卷曲蛋白1～10和低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5／6，抑制β－鏈蛋白進入細胞質(zhì)。從而阻抑Wnt經(jīng)典信號通路，抑制了前體成骨細胞的生長和早期階段的分化，導致OB數(shù)量下降，ALP的活性下降［9－10］。

校正血鈣、骨質(zhì)損害評分主要是反映骨質(zhì)破壞情況，他們與sclerostin有明顯的正相關(guān)。這說明sclerostin能反映骨質(zhì)破壞情況，在MM中可能導致MBD，其具體機制目前不明，可能與巨噬細胞炎癥蛋白1－α相關(guān)［11］。也可能通過抑制Wnt經(jīng)典及非經(jīng)典信號途徑，導致細胞外基質(zhì)成熟障礙、細胞外基質(zhì)礦化降低及骨量減少［12－13］，從而導致 MBD的發(fā)生。Brunetti等［8］發(fā)現(xiàn)MM患者外周血sclerostin與β2－MG呈正相關(guān)，本研究不僅驗證這一點，還發(fā)現(xiàn)sclerostin與M蛋白的比例和ISS分期呈正相關(guān)。β2－MG、M蛋白、ISS臨床分期能較好地反映體內(nèi)瘤負荷水平，這說明sclerostin也能較好地反映瘤負荷及預后，是疾病預后不良的一項指標。其機制可能是sclerostin在抑制骨髓基質(zhì)細胞向OB分化成熟的同時，導致白細胞介素－6及其他促進MM細胞生長的因子生成增多［14］，瘤負荷增高；也可能是sclerostin通過抑制骨髄修復而促進腫瘤細胞的生長［15］。

本研究還發(fā)現(xiàn)，低sclerostin組患者中位生存期均高于高sclerostin組患者。本研究因樣本數(shù)較少，采用為對照組x±2s為分界點，發(fā)現(xiàn)sclerostin大于0.43pg／mL是MM患者預后不良的一個指標。這說明sclerostin能較好地預測MM患者的生存期。其原因可能是該類患者存在較嚴重的骨質(zhì)破壞如壓縮性骨折或病理性骨質(zhì)，需較長時間的臥床，機體的免疫功能差，容易并發(fā)肺部等臟器感染，并發(fā)癥多；也可能是高水平sclerostin在抑制Wnt經(jīng)典信號通路的過程中，白細胞介素－6等促進瘤細胞增殖的因子增多［15］，瘤負荷高，耐藥性增強，對藥物敏感性差，緩解率及中位生存期低。

綜上所述，sclerostin在MM患者骨髓上清液中的水平增高，其水平能反映MM患者骨質(zhì)破壞、成骨受抑的程度及機體瘤負荷的水平，并能在一定程度反映患者的中位生存期，其增高機制還有待研究，為進一步治療MM提供了新的治療靶點。

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