鄭世群，劉金福，吳則焰，洪 偉，徐道煒，何中聲

(1.福建農(nóng)林大學林學院;2.福建農(nóng)林大學生命科學學院，福建 福州350002)

水松(Glyptostrobus pensilis)屬杉科水松屬，是我國特有珍稀孑遺樹種(國家一級保護植物).生長于沼澤地，耐水濕，是造船和造橋的良材;樹根輕松、浮力大，可以用來做救生工具和木塞;枝葉和果實可入藥［1］.水松在古生代曾廣布于北半球，由于地史因素和人為活動影響，數(shù)量日益減少，已處于瀕危狀態(tài)，目前僅零星分布于我國南方.在研究杉科植物系統(tǒng)發(fā)育、古植物學和第四紀冰川氣候等方面，水松具有重要科學價值，被世界保護監(jiān)測中心列為稀有種，被《中國植物紅皮書》列為瀕危樹種［2］.目前水松分布范圍不斷縮小且呈片段化，居群數(shù)量劇烈下降，大部分分布地僅剩幾株孤立木，天然更新難以進行，幼苗幼樹幾乎沒有，且病蟲危害嚴重，加之人為干擾破壞，水松生存與繁殖面臨嚴峻挑戰(zhàn).如何保護水松林稀有珍貴基因與種質(zhì)資源、擴大水松林自然資源已成當務(wù)之急.

水松因其瀕危狀況受到眾多學者高度關(guān)注.韓麗娟等［1-2］對水松生物學特性和保護、次生韌皮部解剖及其系統(tǒng)位置進行分析，斯纓等［3］研究水松葉總黃酮含量，李發(fā)根等［4］探討了水松地理分布和瀕危原因，鄭世群等［5］針對瀕危原因提出保護對策，吳則焰等［6-11］對水松種群生態(tài)學進行研究，但其分子生態(tài)學研究較少.簡單重復序列間區(qū)(inter-simple sequence repeats，ISSR)分子標記技術(shù)具有快速、多態(tài)性高、穩(wěn)定性和重復性好等優(yōu)點［12］，已廣泛用于植物遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建、基因定位、種質(zhì)資源鑒定、植物分類、進化和遺傳多樣性分析等方面［13］.作為基于PCR的一種分子標記，其擴增結(jié)果易受Mg2+、dNTP、DNA模板、Taq DNA聚合酶、引物等因素影響，DNA模板質(zhì)量及穩(wěn)定的PCR反應(yīng)體系是獲得可靠分子標記結(jié)果的前提［14］.根據(jù)Li et al［15］的ISSR反應(yīng)體系重復試驗，結(jié)果并不理想.考慮到反應(yīng)體系會直接影響研究結(jié)果，本實驗室擬研究獲得高質(zhì)量水松基因組DNA的方法，探討建立適合于水松的ISSR-PCR反應(yīng)體系，為水松分子標記和遺傳多樣性研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 供試材料

實驗材料于2008年12月至2009年3月采自于水松主要分布區(qū)福建屏南、三明、南平、福州、江西弋陽、廣東斗門等地，共9個居群，合計100株.每個居群根據(jù)其分布情況隨機選取代表性樣株，每樣株間隔距離至少5 m以上，將采集的每株幼嫩葉片裝入自封袋中，用硅膠干燥保存，在實驗室用液氮處理后，-40℃冷凍保存.

1.2 主要儀器和試劑

主要儀器:高速離心機(Beckman Avanti30 Centrifuge)，紫外分光光度計(WFZ800-D3B)，Thermo PCR(GebeAmpTM PCR Stystm 9700)，紫外凝膠成像系統(tǒng)(Gel Doc 2000TM).

主要試劑:dNTP、Buffer(10×PCR Buffer)、Marker D501A、Ex Taq DNA聚合酶購自寶生生物工程有限公司;隨機引物和ISSR引物購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司;Tris、HCl、EDTA、CTAB、NaCl、β-巰基乙醇、硼酸、PVPP、乙醇、氯仿、異戊醇等均為國產(chǎn)分析純試劑.

1.3 實驗方法

1.3.1 水松基因組DNA提取 ①取0.5 g水松嫩葉放入液氮中研磨成粉，在研磨過程中，加入適量PVPP，轉(zhuǎn)入1.5 mL 離心管中，加入800 μL 65 ℃的2 ×CTAB 提取液(100 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，1.4 mol·L-1NaCl，20 mmol·L-1EDTA，2%CTAB)，另加入16 μL 5%β-巰基乙醇，充分混勻，放在65 ℃水浴保溫30-60 min(每隔15 min搖勻1次);②加入600 μL氯仿—異戊醇(24∶1)，顛倒混勻，在12000 r·min-1離心5 min，將水相轉(zhuǎn)入另一離心管;③重復第2步，即用氯仿-異戊醇(24∶1)再抽提一次;④在水相中加入1/5體積5 mol·L-1NaCl，再加入2/3體積冰冷的異丙醇，輕輕混勻后，置于-20℃ 30 min，然后10000 r·min-1離心5 min收集沉淀;⑤將沉淀用75%乙醇洗2次，在室溫下自然風干4-10 min;⑥將此沉淀溶于合適體積(50-100 μL)0.1 × TE 緩沖液(1.0 mmol·L-1Tris-HCl pH 8.0，0.1 mmol·L-1EDTA pH 8.0)，-20℃保存或4℃待用.

1.3.2 水松基因組DNA的檢測 將提取的DNA樣品適當稀釋，在紫外分光光度計上測定D260nm和D280nm處的吸收值，計算DNA樣品濃度.采用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照，檢測DNA完整性和RNA消化情況.1.3.3 ISSR-PCR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化 選用正交設(shè)計方案優(yōu)化反應(yīng)體系(表1).表中編號即正交試驗設(shè)計的9個處理，以采自福州森林公園的水松DNA為模板，引物為811號(GAGAGAGAGAGAGAGAC)，反應(yīng)總體積為20 μL，反應(yīng)體系中含有2.0 μL 10 ×buffer緩沖液和相應(yīng)體積的ddH2O［16-19］.

PCR反應(yīng)所用程序為:94℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán)35次，最后在72℃延伸10 min，4 ℃保存.

表1 ISSR-PCR體系的正交試驗設(shè)計Table 1 Orthogonal design for ISSR-PCR

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA 提取結(jié)果

經(jīng)過提取與優(yōu)化的水松基因組DNA呈米白色絮狀和無色透明沉淀，電泳結(jié)果呈均一條帶，說明提取的DNA較純，基本去除了蛋白質(zhì)、多糖和酚類等雜質(zhì)(圖1).水松基因組DNA的D260nm與D280nm的比值在1.75-1.85范圍內(nèi)，說明DNA純度較高，符合要求.

2.2 ISSR反應(yīng)體系確定

圖2為正交試驗擴增結(jié)果，由于Taq DNA聚合酶、引物、dNTP和DNA濃度不同，處理效果存在較大差異.

圖2 ISSR-PCR正交試驗擴增結(jié)果Fig.2 The orthogonal design results of ISSR-PCR

圖1 DNA電泳檢測圖Fig.1 The result of genomic DNA gel electrophoresis

dNTP濃度過高會導致聚合酶的錯誤摻入，濃度過低又會影響合成效率，甚至會過早消耗而使產(chǎn)物單鏈化，影響擴增結(jié)果.在PCR反應(yīng)中，dNTP濃度對擴增效果影響較明顯，當dNTP濃度為0.18 mmol·L-1時，擴增條帶較少，特異性也不強;當dNTP濃度為0.12 mmol·L-1時，擴增條帶明顯增多，且譜帶很亮.故選擇 dNTP 濃度為 0.12 mmol·L-1.

DNA模板含量是制約擴增產(chǎn)物得率及特異性的一個重要因子，模板含量過低，分子碰撞幾率低，偶然性大，擴增產(chǎn)物無或不穩(wěn)定;模板含量過高，又會相應(yīng)增加非特異性產(chǎn)物的擴增.水松ISSR-PCR反應(yīng)體系對DNA模板含量許可范圍較大，30-50 ng·μL-1均可擴增出條帶.因此，30 ng的模板DNA即可滿足擴增需要.

在PCR反應(yīng)中，Taq DNA聚合酶使用量也是影響實驗的重要因素.高濃度Taq DNA聚合酶不僅成本高，且易產(chǎn)生非特異性擴增產(chǎn)物;Taq DNA聚合酶濃度過低會導致產(chǎn)物合成效率下降.由表1和圖2可知，在20 μL反應(yīng)體系中，使用2.0 U Taq DNA聚合酶擴增的條帶最清晰，且數(shù)量最多，則選擇的Taq DNA聚合酶的終濃度為2.0 U·μL-1.

在PCR反應(yīng)中，引物濃度過低會導致擴增量不足，條帶很少;濃度過高，會產(chǎn)生新的位點.即選擇引物濃度為 0.12 umol·L-1.

在參考前人研究基礎(chǔ)上［18］將Mg2+濃度定位于 2.0 mmol·L-1，Buffer用量定位于 2.0 μL.所以在20 μL的ISSR體系中，各反應(yīng)成分用量見表2.

由實驗結(jié)果可得，水松ISSR擴增最佳反應(yīng)系:1×Buffer緩沖液，2.0 U Taq DNA 聚合酶，0.12 mmol·L-1dNTP，0.12 umol·L-1引物，DNA模板30 ng·μL-1，dd H2O 補足至體積為 20 μL.反應(yīng)循環(huán)參數(shù):94℃預(yù)變性5 min，94℃變性30 s，52 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min，循環(huán) 35 次，72℃延伸10 min，4℃保存.

2.3 ISSR-PCR的擴增結(jié)果

篩選出的10條ISSR引物對不同種源水松共擴增出95條譜帶(表3)，其中多態(tài)性條帶39條，多態(tài)性條帶百分率為39.98%.平均每條引物擴增出9.5條譜帶和3.9條多態(tài)性條帶.引物873擴增出的條帶最多(13條)，其多態(tài)性條帶為54.0%;引物840擴增出的條帶最少(7條)，多態(tài)性為28.57%.

表2 ISSR-PCR反應(yīng)成分用量Table 2 Composition of reaction on ISSR-PCR

表3 篩選出的引物及其擴增結(jié)果Table 3 The sequence of 10 primers and amplified results

3 討論

DNA模板質(zhì)量直接影響DNA分子標記的分析結(jié)果.水松植物富含多酚和多糖，但不同發(fā)育時期存在較大差異，且居群間差異較大.因此，總結(jié)出一種普遍適用的基因組DNA提取方法較困難.運用改良CTAB法提取成年植株新鮮嫩葉的DNA，其DNA純度高、質(zhì)量好，可以直接用于DNA分子標記.

有關(guān)ISSR-PCR反應(yīng)體系優(yōu)化的報道較多，但大部分研究采用簡單梯度試驗方法對每個因素的最佳水平進行摸索，需進行多次梯度試驗，試驗過程繁瑣，且不能兼顧到各因素間的交互作用，對試驗結(jié)果判斷缺少量化，缺乏一定標準.本實驗采用的正交試驗設(shè)計具有均衡分散、綜合可比、效用明確的特點，確立了適合水松ISSR-PCR反應(yīng)體系，試驗結(jié)果的穩(wěn)定性高、重復性好.

［1］韓麗娟，胡玉熹，林金星，等.中國特有植物水松的生物學特性及其保護［J］.長春師范學院學報，1996，3(2):29-35.

［2］韓麗娟，胡玉熹，林金星.水松的次生韌皮部解剖及其系統(tǒng)位置的討論［J］.植物分類學報，1997，35(6):527-532.

［3］斯纓，王日韋，龔復俊，等.水松葉的總黃酮含量研究［J］.武漢植物學研究，2003，21(6):547-549.

［4］李發(fā)根，夏念和.水松地理分布及其瀕危原因［J］.熱帶亞熱帶植物學報，2004，12(1):13-20.

［5］鄭世群，劉金福，吳則焰，等.我國特有孑遺植物水松瀕危原因及其保護對策［J］.亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2011，7(4):1-4.

［6］吳則焰，劉金福，洪偉，等.孑遺植物屏南水松種群空間分布格局［J］.亞熱帶農(nóng)業(yè)研究，2008，4(1):36-40.

［7］吳則焰，劉金福，洪偉，等.屏南水松天然林主要種群直徑分布規(guī)律研究［J］.林業(yè)勘察設(shè)計，2008(1):4-8.

［8］鄭世群，劉金福，吳則焰，等.屏南水松天然林主要種群的種間競爭［J］.福建林學院學報，2008，28(3):216-219.

［9］劉金福，洪偉，吳則焰，等.孑遺植物水松(Glyptostrobus pensilis)種群生命表和譜分析［J］.武漢植物學研究，2008，26(3):259-263.

［10］吳則焰，劉金福，洪偉，等.孑遺植物水松(Glyptostrobus pensilis)數(shù)量性狀間的相關(guān)聚類分析［J］.北華大學學報:自然科學版，2009，10(4):358-361.

［11］吳則焰，劉金福，洪偉，等.孑遺植物水松(Glyptostrobus pensilis)種群優(yōu)勢度增長規(guī)律研究［J］.武漢植物學研究，2009，27(4):387-390.

［12］ZIETKIEWICZ E，RAFALSKI A，LABUDA D.Genome fingerprinting by simple sequence repeat(SSR)-anchored polymerase chain reaction amplification［J］.Genomics，1994，20(2):176-183.

［13］TALHINHAS T，NEVES-MARTINS J，LEITàO J.AFLP，ISSR and RAPD markers reveal high levels of genetic diversity among Lupinus ssp.［J］.Plant Breeding，2003，122(6):507-510.

［14］唐燕瓊，吳紫云，郭建春，等.柱花草DNA提取及ISSR反應(yīng)體系的正交優(yōu)化［J］.熱帶作物學報，2008，29(3):352-357.

［15］Li F G，Xia N H.Population structure and genetic diversity of an endangered species，Glyptostrobus pensilis(Cupressaceae)［J］.Botanical Bulletin of Academia Sinica，2005，46(2):155-162.

［16］沈永寶，施季森，趙洪亮.利用ISSR DNA標記鑒定主要銀杏栽培品種［J］.林業(yè)科學，2005，41(1):202-204.

［17］楊傳平，魏利，姜靜，等.應(yīng)用ISSR-PCR對西伯利亞紅松19個種源的遺傳多樣性分析［J］.東北林業(yè)大學學報，2005，33(1):1-3.

［18］彭云滔，唐紹清，李伯林，等.野生羅漢果遺傳多樣性的ISSR分析［J］.生物多樣性，2005，13(1):36-42.

［19］KOJMA T，NAGAOKA T，NODA K.Genetic linkage map of ISSR and RAPD markers in Einkom wheat in relation to that of RFLP markers［J］.Theor Appl Genet，1998，96(1):37-45.