陳 霞，汪 洋，駱鵬杰，李 娟，吳聰明

（1．中國(guó)疾病預(yù)防控制中心傳染病預(yù)防控制所 傳染病預(yù)防控制國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 感染性疾病診治協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 昌平102206；2．中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，北京 海淀100193；3．國(guó)家食品安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估中心，北京 朝陽100022）

空腸彎曲菌（下稱空彎）是一種重要的食源性致病菌，是動(dòng)物體內(nèi)的正常菌群［1－2］，可造成人類腸炎的暴發(fā)流行和食物中毒［3］。我國(guó)對(duì)于食品源動(dòng)物空彎的研究尚在起步，但隨著國(guó)際貿(mào)易的繁榮和我國(guó)對(duì)食品安全的日益重視，食品動(dòng)物源空彎病的流行分布和耐藥性研究愈來愈受到廣泛的重視。喹諾酮類藥物由于其高效、廣譜的抗菌特點(diǎn)，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)曾長(zhǎng)期、廣泛地使用，不少研究也報(bào)道了不同細(xì)菌對(duì)于其日趨嚴(yán)重的耐藥情況。

我國(guó)食品動(dòng)物源空彎喹諾酮耐藥性的研究較少［4］。本文通過對(duì)采集自2008年山東省的雞源空彎進(jìn)行喹諾酮類耐藥機(jī)制的闡述，為我國(guó)動(dòng)物源性空彎耐藥性現(xiàn)狀的了解和評(píng)估提供可靠的數(shù)據(jù)，對(duì)獸醫(yī)及人醫(yī)領(lǐng)域有著十分重要的公共衛(wèi)生意義。

1 材料與方法

1．1 菌株背景 202株空彎采集于2008年山東省五地的大型綜合肉雞屠宰場(chǎng)，其背景信息已有文章詳述［4］，歸納如下：202株空彎分離株對(duì)受試的喹諾酮類藥物均呈現(xiàn)非常高的耐藥率和耐藥水平，超過98%的菌株對(duì)喹諾酮耐藥。

1．2 主要試劑 普通PCR用2×TaqPCR MasterMix，購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；測(cè)序PCR用PremixExTaq＠version 2．0，購(gòu)自 TaKa－Ra寶生物工程（大連）有限公司。

1．3 可移動(dòng)喹諾酮耐藥基因的篩查 按照已有文獻(xiàn)對(duì)常見的7種可移動(dòng)喹諾酮耐藥基因進(jìn)行篩查［5］。

1．4gyrA和gyrB基因相關(guān)區(qū)域研究及parC的測(cè)定 采用錯(cuò)配擴(kuò)增PCR（MAMA PCR）對(duì)所有空彎的gyrAQRDR 的 C－257－T 突變進(jìn)行檢測(cè)［6］，利用普通PCR對(duì)parC基因進(jìn)行測(cè)定［7］。

挑選環(huán)丙沙星（喹諾酮類代表藥物）不同耐藥水平空彎進(jìn)行g(shù)yrA和gyrB相關(guān)區(qū)域測(cè)序，使用引物如文獻(xiàn)所述［8－9］。

2 結(jié)果

2．1 可移動(dòng)喹諾酮耐藥基因的篩查情況 通過對(duì)202株空彎進(jìn)行7種常見的喹諾酮耐藥基因篩查，未發(fā)現(xiàn)在受試空彎中存在任何可移動(dòng)的喹諾酮耐藥基因。

2．2 QRDR的突變測(cè)定及對(duì)parC基因的測(cè)定結(jié)果 對(duì)202株空彎進(jìn)行g(shù)yrAQRDR特異性點(diǎn)突變C－257－T的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)除龍口地區(qū)一株環(huán)丙沙星低水平耐藥（MIC＝8μg／mL）空彎外，所有環(huán)丙沙星耐藥空彎均存在此點(diǎn)的突變，質(zhì)控菌株及敏感菌不存在此突變。

在gyrA相關(guān)區(qū)域測(cè)序，發(fā)現(xiàn)93株環(huán)丙沙星耐藥彎曲菌存在C－257－T的點(diǎn)突變，低耐、敏感空彎及質(zhì)控菌株ATCC 33560不存在該突變。另外，環(huán)丙沙星耐藥空彎中存在多個(gè)沉默突變，未見其他有義突變。在gyrA相關(guān)區(qū)域中，存在最多的沉默突變是C－243－T和 C－357－T，存在于除質(zhì)控菌株 ATCC 33560外的所有受檢彎曲菌中；其他常發(fā)生的沉默突變包括 C－360－T、C－471－T、C－483－T、A－608－G、C－622－T。較少發(fā)生的沉默突變 T－603－C（n＝7，鄒平）、A－624－G（n＝2，龍口低耐及敏感菌株）和 C－645－T（n＝2，龍口低耐及敏感菌株），見表1。

gyrB基因相關(guān)區(qū)域測(cè)序顯示不存在有義突變。存在最多的位點(diǎn)沉默突變是C－1308－T和C－1360－T，分別有23株和22株；C－1467－T發(fā)生在采集自鄒平的2株菌株中；G－1383－A，C－1404－T和C－1413－T突變發(fā)生在同一株采集于鄒平的菌株中；另有16株環(huán)丙沙星耐藥空彎未檢測(cè)到任何突變，見表1。

對(duì)所有空彎進(jìn)行parC的擴(kuò)增，但并沒有成功。

表1 空彎gyrA和gyrB相關(guān)區(qū)域點(diǎn)突變情況

3 討論

細(xì)菌喹諾酮耐藥性和耐藥基因的貢獻(xiàn)關(guān)系密切。如存在于腸桿菌科細(xì)菌的qnr、qepA等，它們可多種細(xì)菌間廣泛傳播，幫助低耐細(xì)菌數(shù)量增加從而達(dá)到出現(xiàn)突變所需要的濃度，引起高水平耐藥［5］，本研究檢測(cè)了7種喹諾酮耐藥基因，但并沒有任何發(fā)現(xiàn)，這和之前的研究結(jié)果相同［10］。

空彎對(duì)喹諾酮類藥物的耐藥與gyrA基因上QRDR特異性點(diǎn)突變密切相關(guān)［10－12］。本研究經(jīng)檢測(cè)均存在gyrA上QRDR的熱點(diǎn)突變C－257－T。該點(diǎn)突變引起的Thr－86－Ile轉(zhuǎn)換能夠造成空彎對(duì)環(huán)丙沙星的高水平耐藥。另外，還有其他一些介導(dǎo)中介水平的喹諾酮耐藥的單突變?nèi)缁螂p重突變［9－10］在本研究中未有發(fā)現(xiàn)。本研究中除2株空彎（MIC＝8 μg／mL）外，其他環(huán)丙沙星耐藥空彎對(duì)環(huán)丙沙星的MIC≥32μg／mL［4］，未發(fā)現(xiàn)除C－257－T外的其他相關(guān)點(diǎn)突變，暗示在gyrAQRDR的C－257－T與彎曲菌環(huán)丙沙星高水平耐藥表型有明顯關(guān)系。

本研究中還通過測(cè)序在相關(guān)序列中發(fā)現(xiàn)多個(gè)沉默突變。部分沉默突變僅存在于一個(gè)或兩個(gè)地區(qū)的菌株中，這提示在同一地區(qū)中流行著具有相同沉默突變的gyrA、gyrB基因亞型。

有報(bào)道parC基因的突變能夠介導(dǎo)高水平喹諾酮耐藥［7］，本研究按照文獻(xiàn)引未能成功擴(kuò)增parC基因，這和很多不同學(xué)者都沒能成功檢測(cè)出彎曲菌中存在parC，不能進(jìn)行相關(guān)后續(xù)試驗(yàn)［10］的報(bào)道結(jié)果一致，提示絕大多數(shù)空彎中不存在ParC。

綜上，本研究通過對(duì)采集自我國(guó)山東地區(qū)的雞源空彎進(jìn)行喹諾酮類耐藥機(jī)制探討，確定菌株的高水平喹諾酮耐藥表型與gyrA上QRDR的熱點(diǎn)突變C－257－T密切相關(guān)。存在于gyrA和gyrB基因上的部分沉默突變有地域性流行特點(diǎn)。作為一種動(dòng)物體內(nèi)共生，可治人類疾病的細(xì)菌，空彎耐藥性應(yīng)引起足夠重視，加強(qiáng)對(duì)其的耐藥性監(jiān)控和耐藥性機(jī)制研究，對(duì)于獸醫(yī)、人醫(yī)了解空彎耐藥現(xiàn)狀，防控其傳播和流行有著重大的公共衛(wèi)生意義。

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