張建平，胡海英，張正全

（鄭州大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州450001）

氟苯尼考（Florfenicol）是20世紀(jì)80年代由先靈－葆雅公司研制的一種新型獸醫(yī)專用氯霉素類廣譜抗菌藥，具有抗菌譜廣、體內(nèi)分布廣泛，特別是無潛在的致再生障礙性貧血的不良反應(yīng)等特點(diǎn)，對敏感菌所致的畜禽細(xì)菌性疾病治療效果顯著。2000年該藥在我國批準(zhǔn)為國家二類新獸藥，但在目前的氟苯尼考使用中存在不同劑型，及同一劑型的不同生產(chǎn)廠家產(chǎn)品在療效上存在巨大差異，因此有必要對氟苯尼考的溶解度行為、生物吸收行為進(jìn)行研究，以期找到臨床療效差異的原因及為高效快速吸收的制劑提供參考。飽和溶解度是藥物重要的物理化學(xué)參數(shù)之一，藥物溶解度的大小及在吸收部位溶解的狀態(tài)直接影響了藥物的吸收。大鼠在腸內(nèi)循環(huán)模型研究藥物吸收的方法，能避免胃內(nèi)容物和消化道固有生理活動(dòng)對結(jié)果的影響，可較客觀的反映藥物在腸道內(nèi)的實(shí)際吸收情況［1］。作者采用該模型考察了氟苯尼考的大鼠腸內(nèi)的吸收情況，為該藥設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)慕o藥劑型提供一定參考。

1 材料

1．1 材料及儀器 氟苯尼考原料藥（湖北龍翔藥業(yè)有限公司，批號：101152）；0．9%生理鹽水（自制）、酚紅（分析純）、甲醇（色譜純）及其他試劑均為分析純；Angilent－1200高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AKasil C18色譜柱（Ajela博納艾杰爾科技有限公司）；UV－2102型紫外分光光度計(jì)（尤尼柯上海儀器有限公司）；DV15cd分析天平（梅特勒－托利多儀器公司，上海）。

1．2 試驗(yàn)動(dòng)物 清潔級健康大鼠，體重200g±10 g，購自河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號：410118。

2 方法

2．1 溶液的配制 Krebs－Ringer（K－R）磷酸緩沖液［2］：配制 pH 值7．4的 Krebs－Ringer磷酸鹽緩沖液；腸循環(huán)液：在K－R緩沖液中加入適量的酚紅和氟苯尼考，使酚紅濃度20μg／mL，氟苯尼考濃度分別為 50μg／mL、100μg／mL、200μg／mL，取 100 mL作為腸循環(huán)吸收液。

2．2 酚紅測定方法的建立 酚紅的最大吸收波長為558nm，用紫外可見分光光度計(jì)測定其濃度，圖譜顯示無其他雜質(zhì)峰干擾，小腸對酚紅基本無吸收，因此可以通過酚紅的濃度校正循環(huán)液體積。

2．2．1 酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 用K－R緩沖液配制100μg／mL的酚紅作為儲(chǔ)備液，用K－R緩沖液稀釋至不同濃度，得濃度分別為4．95、9．9、14．85、19．8、29．7μg／mL酚紅標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取上述濃度標(biāo)準(zhǔn)液0．5mL，置試管中，加入0．2mol／L氫氧化鈉溶液0．5mL，搖勻，微孔濾膜過濾，以0．2mol／L氫氧化鈉溶液為空白，在558nm處測定其吸光度A。

2．2．2 回收率測定 分別配制4．95、14．85、29．7 mg／mL酚紅標(biāo)準(zhǔn)液各3份，加入氟苯尼考原料藥，使其濃度為200μg／mL，按“2．2．1”項(xiàng)下方法處理，測定吸光度A，計(jì)算3種濃度酚紅的回收率。

2．3 氟苯尼考方法學(xué)建立 氟苯尼考最大吸收波長為224nm，其他成分在此波長處測定無干擾，用高效液相色譜法（HPLC）測定。色譜條件：Akasil－C18（4．6mm×250mm，5μm），流動(dòng)相為甲醇－水（40∶60v／v），流速1mL／min，進(jìn)樣量20μL，柱溫25℃。理論塔板數(shù)按氟苯尼考峰計(jì)算應(yīng)不低于6×103，在該色譜條件下氟苯尼考峰與雜質(zhì)峰的分離度應(yīng)符合要求（如圖1）。

圖1 氟苯尼考色譜圖

2．3．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 氟苯尼考的標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密稱取氟苯尼考9．9mg，用甲醇溶解，配成100μg／mL儲(chǔ)備液，分別吸取一定量的儲(chǔ)備液用蒸餾水稀釋至4．95、9．9、19．8、39．6、49．5μg／mL的氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液，10 000r／min離心15min，取上清液按“2．2．2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣檢測。

2．3．2 精密度考察 取質(zhì)量濃度分別為4．95、19．8、49．5μg／mL氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液，加入酚紅，使其濃度為20μg／mL，分別連續(xù)進(jìn)樣3次，連續(xù)進(jìn)樣3d，檢測氟苯尼考的濃度，求得方法的日內(nèi)、日間精密度。

2．4 氟苯尼考飽和溶解度的測定［3－4］分別精密量取蒸餾水、乙醇、丙酮各10mL，置25mL錐形瓶中，平行3份，分別于25℃逐漸加入氟苯尼考至溶液中出現(xiàn)不溶性粉末為止。25℃恒溫振蕩器中強(qiáng)力振蕩（200r／min），48h后取出，取5mL，5 000r／min離心10min，精密量取上清液適量稀釋，參照“2．2．2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣檢測，得氟苯尼考的飽和溶解度；余下飽和溶解度樣品繼續(xù)強(qiáng)力振蕩（200r／min），24h后取出，上述同法測定氟苯尼考的飽和溶解度，對比兩次測定結(jié)果的一致性。

2．5 氟苯尼考在大鼠腸內(nèi)吸收試驗(yàn) 取試驗(yàn)前禁食12h（自由飲水）的大鼠3只，乙醚麻醉后將其固定于固定臺(tái)上，用取暖器保持37℃體溫。沿腹部中線切開腹部（約3cm），在十二指腸上部和回腸下部各切一小口（盡可能避開血管），在十二指腸小口處插入直徑約1cm的塑料管，用棉線扎緊。用蠕動(dòng)泵將37℃的生理鹽水緩緩注入腸管，洗去腸管內(nèi)容物。洗凈后在回腸下部的小口處插入相同的塑料管，并用棉線扎緊。將腸管兩端的塑料管與蠕動(dòng)泵相連，形成回路，將腸內(nèi)殘留的生理鹽水盡量流盡后通入循環(huán)液，開始腸循環(huán)。回流開始后10min，從循環(huán)液中取樣2份樣品，一份1．0mL，另一份0．5 mL，分別作為藥物和酚紅的零點(diǎn)時(shí)間樣品。其后每隔10min取相同2份，每次取樣后立即補(bǔ)充1．5 mL酚紅溶液（20μg／mL），取樣至120min后停止回流，取出回流段小腸，測量其面積。

將1mL循環(huán)液樣品10 000r／min離心15min后取上層液進(jìn)樣檢測，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算各個(gè)時(shí)間點(diǎn)循環(huán)液中藥物濃度。另一份0．5mL循環(huán)液樣品加入5mL 0．2mol／L氫氧化鈉溶液，混勻，10 000 r／min離心15min，取上層液在558nm波長處紫外檢測，計(jì)算循環(huán)液中酚紅濃度。通過酚紅濃度校正循環(huán)液體積，計(jì)算藥物的剩余量。

3 結(jié)果

3．1 酚紅方法考察結(jié)果

3．1．1 酚紅標(biāo)準(zhǔn)液在558nm處測定其吸光度A

以吸光度A對分紅濃度C進(jìn)行線性回歸，得回歸方程：A＝0．016 5C＋0．001 0（R2＝0．999 3），線性范圍為4．95～29．7μg／mL。

3．1．2 由“2．2．2”項(xiàng)下方法測定酚紅回收率 各個(gè)濃度的RSD均小于15%，說明酚紅回收率良好，可以滿足測定的要求。

3．2 氟苯尼考方法考察結(jié)果

3．2．1 由“2．3”項(xiàng)下色譜條件測定氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積。以峰面積Y對濃度C進(jìn)行線性回歸，得標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程：Y＝44．159C＋23．375（R2＝0．999 6），線性范圍為4．95～49．5μg／mL。

3．2．2 由“2．3”項(xiàng)下色譜條件測定氟苯尼考的精密度。氟苯尼考的日內(nèi)、日間精密度分別為5．79%、5．44%，均小于15%，可以滿足測定要求。

3．3 氟苯尼考溶解度 由“2．3”項(xiàng)下色譜條件測定氟苯尼考溶解度，氟苯尼考在蒸餾水、乙醇、丙酮中的飽和溶解度分別為1．224、26．88、78．91mg／mL，在水中的溶解度較低，有機(jī)溶劑中溶解度增加。

3．4 氟苯尼考在體腸循環(huán)結(jié)果 循環(huán)結(jié)束后測得小腸的面積，并根據(jù)剩余量（S）＝St－Wt；Wt＝Ct－1·Vt－1－Ct·Vt；Vt＝［（Vt－1－1．5）·Pt－1＋1．5P］／Pt。

吸收率R＝（初始藥量－120min剩余藥量）／初始藥量×100%；

St－t時(shí)間藥物的剩余量；Wt－t時(shí)間小腸吸收的藥量；

Ct－t時(shí)間循環(huán)液中藥物的濃度，可通過液相色譜法測得；Vt－t時(shí)間循環(huán)液體積；

Pt－t時(shí)間循環(huán)液中酚紅的濃度，可通過紫外分光光度法測得。

計(jì)算結(jié)果見表1～3。

以剩余量（S）的對數(shù)對時(shí)間t作圖得到1條直線（如圖4），以直線斜率b求出吸收速率常數(shù)：ka＝－2．303×60b，根據(jù)t1／2＝－0．693／ka求出半衰期，根據(jù)吸收率公式求出吸收率，并且根據(jù)小腸面積計(jì)算出單位時(shí)間單位面積（h·100cm2）的吸收率，結(jié)果如表4所示。

表1 低濃度氟苯尼考大鼠腸循環(huán)

表2 中濃度氟苯尼考大鼠腸循環(huán)

表3 高濃度氟苯尼考大鼠腸循環(huán)

由表1～3得氟苯尼考在大鼠腸內(nèi)吸收結(jié)果，見表4。

由表4可知，低、中、高濃度大鼠腸吸收的吸收速率常數(shù)分別為0．221h－1、0．221h－1、0．235h－1，半衰期分別為3．135 7h、3．135 7h、2．961 5h，2h吸收率分別為為35．75%、36%、35．56% ，循環(huán)液中藥物濃度下降與循環(huán)時(shí)間呈線性，說明氟苯尼考的吸收為一級動(dòng)力學(xué)吸收過程，以被動(dòng)擴(kuò)散為主。

圖2 lg（剩余量）與時(shí)間t的關(guān)系圖

表4 氟苯尼考腸吸收

4 討論

在腸內(nèi)循環(huán)模型廣泛應(yīng)用于藥物處方前的研究工作，該模型保證了胃腸道神經(jīng)及內(nèi)分泌輸入的完好無損，且血液及淋巴液供應(yīng)不變，大鼠胃腸道的生理狀況與人相似，因此該模型較好地模擬預(yù)測體內(nèi)吸收情況。由于試驗(yàn)中腸道能吸收或排泄水分，循環(huán)液體積會(huì)發(fā)生改變，因此本試驗(yàn)采用酚紅來標(biāo)定循環(huán)液體積（酚紅為大分子絡(luò)合物，小腸對其基本無吸收）。

本試驗(yàn)通過對氟苯尼考在不同溶劑中的溶解度測定，可知氟苯尼考水溶性低于脂溶性，推測氟苯尼考溶解度低，生物滲透性差，原料藥的生物利用度可能較低。試驗(yàn)中建立的大鼠在腸內(nèi)循環(huán)模型對氟苯尼考的吸收作了考察，原料藥吸收率較低，進(jìn)一步證明氟苯尼考生物利用度低，該藥可能是生物藥劑學(xué)中的第三類藥物，即溶解度低，生物滲透性低，可考慮將其制成速釋或長效制劑，有文獻(xiàn)報(bào)道將氟苯尼考制成固體分散體［5］、納米粒乳［6］、微球［7］等新型給藥系統(tǒng)，對該藥物的溶解性能和吸收有一定貢獻(xiàn)。本試驗(yàn)通過對氟苯尼考溶解度及在腸內(nèi)吸收的考察，達(dá)到了一定的預(yù)期目標(biāo)，為今后氟苯尼考進(jìn)一步研究及深層次的推廣做出了一定貢獻(xiàn)。

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［4］ Chernorukov N G，Nipruk O V，Knyazev A V，etal．State of difficultly soluble uranosilicates MIHSiUO6·nH2O （M＋＝Li＋，Na＋，K＋，Rb＋，Cs＋，NH＋4）in saturated aqueous solutions［J］．Radiochemistry，2004，46（5）：452－456．

［5］ 劉洋，趙修華，祖元?jiǎng)?，等．氟苯尼考PEG 6000固體分散體的無溶劑熔融法制備與分析［J］．中國獸藥雜志，2012，46（4）：40－43．

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