何書海

（信陽農(nóng)業(yè)高等?？茖W(xué)校動(dòng)物科學(xué)系，河南 信陽464000）

中藥以其獨(dú)特的療效依然在獸醫(yī)臨床上發(fā)揮著其不可替代的作用。目前中獸藥以散劑、煎劑為主，藥效的發(fā)揮因劑型和采食限制而受到影響，配方顆粒劑因此應(yīng)運(yùn)而生。配方顆粒劑又稱作免煎劑，即是將單一中藥飲片經(jīng)過對(duì)有效成分提取加工濃縮后制成的顆粒劑，便于臨床調(diào)配［1］。它是發(fā)展我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥的一種有益嘗試，但中藥免煎組合方劑的藥效作用能否與傳統(tǒng)煎劑一致，這在學(xué)術(shù)界一直存有爭(zhēng)議［2］。雖然有研究對(duì)驗(yàn)證免煎劑的藥效和質(zhì)量控制做了一些有益的嘗試，但要最終解決爭(zhēng)議、消除懷疑依然任重而道遠(yuǎn)；因此對(duì)中藥材的不同劑型與免煎顆粒劑進(jìn)行有效成分含量及藥效進(jìn)行觀察比較將是一個(gè)有效的手段。為了更加客觀真實(shí)地觀察獸藥生產(chǎn)工藝對(duì)中藥有效成分含量及藥效的影響，根據(jù)前期研究?jī)?nèi)容［3］，本試驗(yàn)擬選用魚腥草利用獸藥生產(chǎn)中式生產(chǎn)設(shè)備將其制備成不同劑型，同時(shí)檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，以期為探討免煎劑與傳統(tǒng)煎劑之間的關(guān)系提供科學(xué)佐證。

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)均證明，魚腥草具有抗菌、清熱、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)咳、利尿之功效，在獸醫(yī)臨床上魚腥草常用于感染性疾病的治療?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，魚腥草的主要活性成分為揮發(fā)油和黃酮類化合 物，這類物質(zhì)具有清熱解毒、利尿通便、抗菌消炎、抗氧化、消除體內(nèi)自由基等藥理作用［4］，而槲皮素是黃酮類化合物的代表之一。結(jié)合本試驗(yàn)為探討免煎劑與傳統(tǒng)煎劑之間關(guān)系的目的，本試驗(yàn)擬檢測(cè)不同劑型魚腥草中槲皮素含量，同時(shí)觀察不同制劑魚腥草的體外抑菌效果。類似研究尚未見報(bào)道。

1 材料與方法

1．1 藥物 魚腥草干草（魚腥草洗凈60℃烘箱干燥2h左右至恒重），槲皮素標(biāo)準(zhǔn)樣品（分析純，Sig－ma公司提供），其余藥品均為分析純。

1．2 菌種與培養(yǎng)基 大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌（本校微生物實(shí)驗(yàn)室提供）；葡萄糖酚紅肉湯（普通液體培養(yǎng)基含葡萄糖1%、酚紅0．002%）。

1．3 儀器 DC－NSG型實(shí)驗(yàn)型提取濃縮機(jī)組（上海達(dá)程實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；DC－1500型實(shí)驗(yàn)型噴霧干燥機(jī)（上海達(dá)程實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；TU－1810型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；JA2103N電子天平，TGL－16G高速離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）。

1．4 魚腥草不同制劑的制備

1．4．1 制取工藝 （1）參照相關(guān)文獻(xiàn)［5］和預(yù)試驗(yàn)結(jié)果，物料比選擇1∶15。即取魚腥草5 000g加水70 000mL，同時(shí)加乙醇和25%鹽酸（體積比為4∶1）混合提取液5 000mL，置于DC－NSG型實(shí)驗(yàn)型提?。饪s）機(jī)組中進(jìn)行回流提取。提取物料溫度為90℃，提取時(shí)間30min；濃縮物料溫度為80℃，真空度為0．06MPa，濃縮至5 000mL（料液比濃度為1g／mL）備用。（2）取上述濃縮液2 500mL置于DC－1500實(shí)驗(yàn)型噴霧干燥機(jī)噴霧干燥，收集全部粉末，備用。

1．4．2 樣品處理及含量分析 根據(jù)槲皮素溶于乙醇的特點(diǎn)，將噴霧干燥原粉用80%乙醇稀釋，定容至2 500mL；再分別量取魚腥草濃縮原液（簡(jiǎn)稱“原藥濃縮液”）和噴霧干燥粉醇溶液（簡(jiǎn)稱“干粉醇溶液”）10．0mL置于 15mL離心管中，在10 000r／min條件下離心10min，移取上清液作為供試品溶液。

1．5 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線的制定 精密稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品10．000mg，置10mL容量瓶中，加80%乙醇溶解并定容，制成濃度為1mg／mL的儲(chǔ)備液。以此儲(chǔ)備液為參比液在200～500nm范圍用紫外可見分光光度計(jì)掃描，選擇適宜波長(zhǎng)。分別量取儲(chǔ)備液0．0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5、3．0、3．5mL 于10mL容量瓶中，80%乙醇定容、搖勻，配制成質(zhì)量濃度分別為0．00、0．05、0．10、0．15、0．20、0．25、0．30、0．35 mg／mL的溶液，在適宜波長(zhǎng)處測(cè)定吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程。

1．6 不同制劑中槲皮素含量測(cè)定 將上述供試液分別置于TU－1810型紫外可見分光光度計(jì)中，選擇適宜波長(zhǎng)測(cè)定供試品的吸光度；由回歸方程計(jì)算出不同樣品中的槲皮素含量。

1．7 魚腥草不同制劑最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定按《中國獸藥典》規(guī)定，魚腥草體外抑菌試驗(yàn)濃度為1g／mL。分別取原藥濃縮液（原藥濃縮液組）和干粉水溶液（干粉水溶液組）分別對(duì)大腸桿菌、沙門菌、鏈球菌進(jìn)行最小抑菌濃度的測(cè)定，每種細(xì)菌3個(gè)重復(fù)。在無菌條件下，將上述各藥液分別用葡萄糖酚紅肉湯作管外梯度稀釋，每種菌的1～9號(hào)管，藥物的稀釋濃度分別為1∶5，1∶10，1∶20，1∶40，1∶80，1∶160，1∶320，1∶640，1∶1 280，第10號(hào)管不加藥物作為對(duì)照，每管藥液均為1mL，每管菌量均為0．1mL，混合均勻，37℃培養(yǎng)24h，取出觀察細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)照管液體為紅色，細(xì)菌生長(zhǎng)管為黃色。無細(xì)菌生長(zhǎng)的最低藥物濃度即為對(duì)該菌株的最低抑菌濃度（MIC）。

2 結(jié)果

2．1 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 以80%乙醇溶液為參比液，將槲皮素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液在200～500nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，得到其最大吸收波長(zhǎng)分別位于256nm和362nm附近。結(jié)合前人研究結(jié)果［6］，本試驗(yàn)采用362nm為測(cè)定波長(zhǎng)對(duì)魚腥草的槲皮素含量進(jìn)行測(cè)定。

2．2 槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)曲線 以濃度（C）對(duì)吸光度（A）作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并且進(jìn)行線性回歸分析，結(jié)果表明，槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液在濃度與吸光度之間呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。經(jīng)回歸處理得方程：C＝10．9770A0．0062（C＝mg／mL），決定系數(shù)r2＝0．9924。（圖1）。

圖1 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線與回歸方程

2．3 不同制劑中槲皮素的含量 如表1所示，通過紫外分析不同制劑中槲皮素的吸光值，結(jié)果表明，魚腥草原藥濃縮液中槲皮素的平均吸光度為0．253 7（λ＝362nm），干粉乙醇稀釋液中槲皮素的平均吸光度為0．246 1（λ＝362nm）。經(jīng)過回歸方程計(jì)算，原藥濃縮液中的槲皮素含量為2．778 7mg／mL，干粉乙醇稀釋液中槲皮素的含量為2．695 2mg／mL；兩組數(shù)值在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無顯著差異。

表1 不同制劑中槲皮素吸光度值

2．4 不同制劑魚腥草抑菌效果 如表2所示，試驗(yàn)結(jié)果表明，魚腥草原藥濃縮液對(duì)大腸桿菌、沙門菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度分別為12．5mg／mL、6．25mg／mL、3．12mg／mL，3次重復(fù)試驗(yàn)顯示，在此濃度下抑菌效果有效率達(dá)到100%；魚腥草干粉乙醇稀釋液對(duì)大腸埃希氏菌、沙門菌和金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度為25．0mg／mL、6．25 mg／mL、6．25mg／mL，其中對(duì)沙門菌抑菌試驗(yàn)時(shí)，在相應(yīng)濃度下的3次重復(fù)試驗(yàn)中2次有效。對(duì)其余兩種細(xì)菌的抑菌能力為100%。

表2 魚腥草不同制劑抑菌效果 （n＝3）

3 討論

本試驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)型回流提?。饪s）機(jī)組對(duì)魚腥草進(jìn)行了提取和濃縮，同時(shí)利用噴霧干燥機(jī)對(duì)濃縮液制備成了干粉；該中試生產(chǎn)線型的提取（濃縮）及干燥設(shè)備將更客觀真實(shí)地觀察生產(chǎn)設(shè)備及制備工藝對(duì)中藥有效成分及藥效的影響。吳景林［5］、羅顯華［7］等曾分別采取了索氏提取器回流提取、超聲波提取和簡(jiǎn)單煎煮法對(duì)魚腥草槲皮素的提取工藝進(jìn)行了研究，對(duì)于利用回流濃縮機(jī)組提取魚腥草有效成分的研究尚未見報(bào)道。本試驗(yàn)通過對(duì)兩種魚腥草制劑中槲皮素有效含量的測(cè)定，結(jié)果顯示，兩種制劑工藝對(duì)槲皮素含量的影響在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無明顯差異，但是從吸光度數(shù)值上觀察到魚腥草干粉醇溶液的吸光度對(duì)比原藥濃縮液有一定程度的降低。這可能是由于在噴霧干燥制粉中，制備工藝使部分槲皮素的含量減少，從而影響了吸光度。

有文獻(xiàn)表明［8－9］，魚腥草合成制劑以及魚腥草注射液的體外抑菌能力很強(qiáng)，其中對(duì)溶血性鏈球菌、金黃色葡萄球菌等有明顯的抑制作用；對(duì)大腸埃希氏菌、痢疾桿菌等也有作用。本研究利用所制取的魚腥草原藥濃縮液和干粉醇溶液對(duì)大腸桿菌、沙門菌、金黃色葡萄球菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，以期獲得不同制劑魚腥草的最小抑菌濃度。結(jié)果顯示，原來濃縮液對(duì)上述3種細(xì)菌的最小抑菌濃度均低于干粉醇溶液。魚腥草有效成分主要包括揮發(fā)油和黃酮類，揮發(fā)油內(nèi)抗菌有效成分主要包括癸酰乙醛、月桂醛、蒎烯和芳樟醇等，在利用蒸汽式噴霧干燥機(jī)對(duì)魚腥草濃縮液干燥時(shí)，使得大量的揮發(fā)油隨高溫蒸汽從排氣口逸散，因此影響了魚腥草的抑菌效果。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在制備中藥免煎劑時(shí)制備工藝對(duì)藥物含量及藥效均有不同程度的影響。雖然中藥免煎顆粒劑替代煎劑是發(fā)展我國傳統(tǒng)中醫(yī)藥的一種積極嘗試，但我國目前尚沒有統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，所以質(zhì)量控制研究是中藥免煎顆粒劑在獸醫(yī)臨床進(jìn)一步推廣應(yīng)用的基礎(chǔ)。姜泓等以藥材有效成分

提取率為指標(biāo)，對(duì)麻黃、甘草、苦杏仁等進(jìn)行了配方免煎劑的制備工藝和質(zhì)量控制研究，結(jié)果表明，以這些藥材制成配方顆粒免煎劑在工藝上是可行的，并以其有效成分作為質(zhì)量控制指標(biāo)是合理的［10－11］。陳黎等采用薄層色譜法和高效液相色譜法對(duì)牛蒡子、炒牛蒡子及其免煎劑中主要成分牛蒡苷進(jìn)行鑒別及含量測(cè)定，結(jié)果顯示，牛蒡子生品與炮制品中牛蒡苷的含量均符合藥典限度要求，免煎劑中牛蒡苷含量?jī)H為炮制品中的三分之一［12］。蘇鑫等研究了保元湯不同調(diào)劑形式對(duì)脾虛小鼠負(fù)重游泳及MΦ吞噬功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，保元湯的傳統(tǒng)煎劑和免煎劑均對(duì)小鼠的免疫功能有一定的提高作用，而傳統(tǒng)煎劑的療效更為明顯［13］。雖然部分免煎中藥顆粒的療效與傳統(tǒng)飲片相近甚至效果更好，但不能肯定所有的配方臨床療效都等同于傳統(tǒng)的中藥煎劑。本試驗(yàn)以單味中藥魚腥草進(jìn)行了有效成分含量的測(cè)定和藥效的觀察，結(jié)果顯示，經(jīng)噴霧干燥后的魚腥草干粉對(duì)3種細(xì)菌的體外抑菌能力較原藥濃縮液要低；任非等通過對(duì)比10種中藥飲片和4種方劑的煎劑與免煎顆粒劑的抑菌作用發(fā)現(xiàn)，免煎顆粒劑的抑菌作用弱于煎劑［14］，與本研究有相似的結(jié)論。“群藥共煎”是中藥的主要特色，從理論上講，中藥復(fù)方藥理作用并非等同于單味中藥成分提取后的簡(jiǎn)單混合；多味藥物在高溫“共煎”之時(shí)會(huì)產(chǎn)生各種物理及化學(xué)變化，煎出成分較為復(fù)雜［15］。這些成分通過“君臣佐使”的關(guān)系發(fā)揮增強(qiáng)療效、緩和藥性的作用，這是免煎劑是無法做到的，因此免煎劑單味藥之和的藥理效應(yīng)能否等同于傳統(tǒng)中藥煎劑，還有待進(jìn)一步研究。

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