敖鵬，周忠光，韓玉生，尹麗穎，邊曉燕

(黑龍江中醫(yī)藥大學，黑龍江 哈爾濱 150040)

隨著類風濕性關節(jié)炎的基礎和臨床研究，滑膜病變與細胞免疫、體液免疫的關系得到了進一步的明確［1－2］。絕大多數(shù)患者不僅血清類風濕因子(RF)含量升高，且TNF－α、IL－1β、IL－6等細胞因子含量亦升高，這些細胞因子則是 RA發(fā)病的重要因素［3－4］。本項目在研究了伸筋草乙醇和正丁醇提取物對AA大鼠血清RF、TNF－α、IL－1β、IL－6含量影響的基礎上［5－7］，研究氯仿提取物對上述各因子的影響，進一步探討伸筋草不同有效部位治療類風濕性關節(jié)炎的作用及免疫學機制。

1 材料與方法

1.1 藥物與主要試劑

伸筋草氯仿提取物(黑龍江中醫(yī)藥大學實驗中心制備);甲氨喋呤(廣州石歧制藥廠);弗式完全佐劑(美國sigma公司);RF ELISA試劑盒(上海華壹生物科技有限公司);TNF－α、IL－1β、IL－6放射免疫試劑盒(北京福瑞生物工程公司)。

1.2 主要儀器

Stat Fax2100型酶標儀(美國TEC HONLOGYIN公司);γ放免計數(shù)器(GC－2016型，科大創(chuàng)新股份中佳公司)。

1.3 動物與分組

Wistar大鼠50只，清潔級，2～3月齡，雌雄各半，體質量(180±20)g，由黑龍江中醫(yī)藥大學實驗動物中心提供。50只大鼠適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分成5組，即正常對照組、模型組、西藥對照組(甲氨喋呤MTX組)、伸筋草氯仿提取物高劑量治療組(伸氯高組)、伸筋草氯仿提取物低劑量治療組(伸氯低組)。

1.4 造模與給藥

除正常對照組外，各實驗組采用CFA制造佐劑性關節(jié)炎大鼠模型。參照文獻方法［5－9］:實驗第1天，各實驗組大鼠于右后足跖部位皮下注射弗式完全佐劑0.1mL/只，然后在尾巴1/3交界處皮下再注射弗式完全佐劑0.05mL/只;正常對照組注射等量的生理鹽水。

實驗第8天開始灌胃給藥。伸氯高組和伸氯低組分別灌服伸筋草氯仿提取物混懸液，每日1次，每次1mL，連續(xù)服藥 21天，其中伸氯高組含生藥量1 600 mg/mL(8.89g/kg/d);伸氯低組含生藥量800mg/mL(4.44g/kg/d);MTX組，每周灌服MTX混懸液1次，每次1mL，濃度為1.5mg/kg/w;正常對照組和模型組灌服等量蒸餾水。

1.5 取材與檢測

于藥物治療21天后，每只大鼠分別采血3mL，3 000r/min離心10min，分離血清，置－20℃冰箱保存。采用ELISA法檢測RF，放射性免疫法檢測TNF－α、IL－1β和IL－6。

1.6 統(tǒng)計學處理

經上述方法檢測的各組數(shù)據(jù)，應用 SPSS 20.0統(tǒng)計學軟件進行統(tǒng)計，以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗。

2 結果

2.1 伸筋草氯仿提取物對AA大鼠血清RF含量的影響

應用ELISA法檢測各組大鼠血清RF含量，檢測結果見表1。

表1 各實驗組大鼠血清RF檢測結果(±s)

表1 各實驗組大鼠血清RF檢測結果(±s)

注:與正常組相比，△△P＜0.01;與模型組相比，*P＜0.05，＊＊P＜0.01。

分組 n RF(pg/mL)10 33.67 ±3.51模型組 10 81.92 ±3.86△△MTX 組 10 75.34 ±6.55*伸氯高組 10 55.76 ±7.08＊＊伸氯低組 10 66.14 ±5.14正常對照組＊＊

表1所示，模型組與正常對照組相比，AA大鼠血清RF含量明顯增高，差異具有顯著意義(P＜0.01);西藥組(MTX)與模型組相比，AA大鼠血清RF含量有所降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);中藥伸氯高組和伸氯低組與模型組相比，AA大鼠血清RF含量均明顯降低，差異具有顯著性意義(P＜0.01)。

2.2 伸筋草氯仿提取物對 AA大鼠血清TNF－α、IL－1β和IL－6含量的影響

應用放射性免疫法檢測TNF－α、IL－1β和IL－6含量，檢測結果見表2。

表2 各實驗組大鼠血清細胞因子的水平(n=10，±s)

表2 各實驗組大鼠血清細胞因子的水平(n=10，±s)

注:與正常組相比，△△P＜0.01;與模型組相比，＊＊P＜0.01，*P＜0.05，#P＞0.05。

分組 TNF－α(ng/mL)IL－1β(ng/mL) IL－6(pg/mL)正常對照組0.243 ±0.042 0.159 ±0.034 87.51 ±3.86模型組 0.340 ±0.035△△0.267 ±0.039△△ 136.63 ±7.85△△MTX 組 0.260 ±0.035＊＊0.184 ±0.042＊＊ 100.44 ±20.71＊＊伸氯高組 0.264 ±0.020＊＊0.187 ±0.041＊＊ 123.30 ±8.28*伸氯低組 0.280 ±0.054* 0.211 ±0.065* 130.55 ±22.17#

表2所示，模型組與正常組相比，AA大鼠血清TNF－α、IL－1β和IL－6含量均升高，差異具有顯著性意義(P＜0.01);西藥組(MTX)與模型組相比，AA大鼠血清TNF－α、IL－1β、IL－6含量降低，差異具有顯著性意義(P＜0.01);中藥伸氯高組與模型組相比，AA大鼠血清TNF－α、IL－1β、IL－6含量均有明顯降低，差異具有顯著性意義(P＜0.01或P＜0.05);伸氯低組與模型組相比，AA大鼠血清TNF－α、IL－1β含量降低，差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，而IL－6含量無明顯改善(P＞0.05)。

3 討論

伸筋草常被臨床用于治療風寒濕痹、關節(jié)酸痛和跌打損傷等疾病，具有消腫鎮(zhèn)痛、舒筋活絡等功效［10］。現(xiàn)代研究表明，伸筋草主要含有石松堿、棒石松堿、石松靈堿等生物堿成分;伸筋草醇、石松醇、芒柄花醇等三萜化合物;還含有少量的蒽醌類成分和揮發(fā)油類［11］。

近年文獻多有報道，RA的發(fā)病不但與類風濕因子有關，而且與機體細胞因子水平失調密切相關。TNF－α和IL－1β常同時分泌及升高，在RA關節(jié)滑膜病變中起到共同致炎作用;IL－6的升高則能促進B細胞合成RF及產生免疫球蛋白［12－13］。

本項目的前期研究工作已經證實，AA模型大鼠血清中RF、TNF－α、IL－1β和IL－6等細胞因子的含量明顯升高，且造成關節(jié)局部炎性細胞浸潤，大鼠機體處于免疫失調狀態(tài)，導致關節(jié)炎發(fā)病;伸筋草乙醇、正丁醇提取物均能有效降低上述指標［5－7］，同時還應用透射電子顯微鏡觀察到伸筋草醇提物能夠有效控制AA 大鼠關節(jié)滑膜的病理改變［14－15］。

結合項目的前期報導和上述實驗結果，伸筋草提取物，無論是乙醇提取物、正丁醇提取物還是氯仿提取物，對AA大鼠血清RF皆有明顯的抑制作用并且其作用優(yōu)于西藥組，作用效果依次為乙醇提取物、正丁醇提取物、氯仿提取物、MTX;對于TNF－α，三種提取物作用相近，均能明顯降低其含量;對于IL－1β，三種提取物均有明顯的抑制作用，其中乙醇提取物、氯仿提取物高劑量、正丁醇提取物高劑量優(yōu)于氯仿提取物低劑量和正丁醇提取物低劑量;對于IL－6，乙醇提取物與正丁醇提取物的抑制作用優(yōu)于氯仿提取物的作用。

上述結論說明，伸筋草不同提取物均能有效降低血清中細胞因子TNF－α、IL－1β和IL－6的含量，更能明顯降低RF的水平，達到減少關節(jié)炎癥、預防和治療類風濕關節(jié)炎的目的。伸筋草藥源豐富，價格低廉，且無明顯的毒副作用，具有臨床應用價值，因此對其防治類風濕性關節(jié)炎的其它免疫機制有待進一步深入研究。

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