蘇春英，蘇本華，孫靜

(1.濟(jì)南市皮膚病醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250001;2.山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250021;3.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355)

浮萍為浮萍科植物紫萍［Spirodela polyrrhiza(L.)Schleid.］的干燥全草。味辛，性寒，歸肺、膀胱經(jīng)，具有發(fā)汗解表、利水消腫、清熱解毒之功效。主要含有芹菜素、芹菜素－7－單糖苷、木犀草素、木犀草素－7－單糖苷、牡荊素、葒草素等黃酮類化合物，β－胡蘿卜素、葉黃素、環(huán)氧葉黃素等類胡蘿卜素類成分，亞麻酸、棕櫚酸、亞油酸等脂肪酸類成分及以亮氨酸、天冬氨酸、谷氨酸為主要組成的蛋白質(zhì)類成分。具有強(qiáng)心、收縮血管、升高血壓、抗感染、利尿、促進(jìn)黑素細(xì)胞生長、抗凝血等多方面的藥理作用。臨床主要用于風(fēng)熱表證、麻疹不透、隱疹瘙癢、水腫、癃閉、瘡癬、丹毒、燙傷等證的治療。2010年版《中國藥典》僅收載性狀、薄層色譜鑒別和水分檢查，無含量測定標(biāo)準(zhǔn)。

近年來，關(guān)于浮萍的研究多見于臨床應(yīng)用等方面，有關(guān)浮萍中多糖的含量測定方法及本草考證、紫外鑒別、生藥學(xué)研究等已有報(bào)道［1－3］，本文首次采用HPLC法測定浮萍中芹菜素的含量，為浮萍藥材的質(zhì)量控制和合理利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 儀器與試藥

塞多利斯BP211D型電子天平(德國sartorius);TU－1810型紫外－可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);高效液相色譜儀(Waters Alliance 2695);二極管陣列檢測器(Waters PDA 2996);色譜工作站(Waters Empower)。

芹菜素對(duì)照品(批號(hào)111901－201001);水為超純水;甲醇為色譜純;其余試劑均為分析純。

浮萍樣品，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)石俊英教授鑒定為浮萍科植物紫萍［Spirodela polyrrhiza(L.)Schleid.］的干燥全草。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱:Phenomenex－ODS柱(4.6mm ×250mm，5μm);柱溫:40℃;檢測波長:340nm;PDA色譜峰光譜采集范圍:300～400nm;流動(dòng)相:甲醇 －0.2%磷酸溶液(55:45);流速:1.0ml/min;進(jìn)樣量:10μl;理論塔板數(shù)按芹菜素峰計(jì)算應(yīng)不低于3 000。

2.2 檢測波長的選擇 取芹菜素對(duì)照品，用適量甲醇溶解，按分光光度法，在300～400nm之間掃描，在340nm處芹菜素有最大吸收且峰形良好，故確定檢測波長為340nm。

2.3 供試品溶液色譜峰純度檢查 鑒于中藥材難以制備陰性對(duì)照，故選用PDA檢測器對(duì)供試品溶液色譜峰純度進(jìn)行檢查。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在芹菜素保留時(shí)間處，供試品溶液與對(duì)照品溶液的光譜圖完全一致，表明在芹菜素保留時(shí)間處供試品溶液無其它干擾雜質(zhì)。

2.4 線性關(guān)系考察 取五氧化二磷干燥器中減壓干燥48h以上的芹菜素對(duì)照品約25mg，精密稱定，用甲醇溶解并定容至100ml，作為芹菜素對(duì)照品貯備液。分別精密量取對(duì)照品貯備液 1、2、4、8、10ml，用甲醇稀釋并定容至25ml，作為5個(gè)濃度的芹菜素對(duì)照品溶液，分別精密吸取10μl，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以進(jìn)樣量C為橫坐標(biāo)，芹菜素吸收峰面積A為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程為:A=20 456+3 323 637C(r=0.999 9)。表明在0.101 68 ～1.016 8μg范圍內(nèi)，芹菜素進(jìn)樣量與吸收峰面積之間線性關(guān)系良好。

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 取濃度為20.336ug/ml同一芹菜素對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，在上述色譜條件下測定，吸收峰面積分別為:702 833，704 665，707 534，705 509，700 842，平均值 704 277，RSD(%)=0.36%。表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別于制備0、1、2、4、8、10h后 測 定，吸 收 峰面 積 分別 為:1 285 737，1 285 033，1 278 138，1 271 055，1 275 826，1 254 859，平均值 1 275 108，RSD(%)=0.89%。表明在制備后10h內(nèi)供試品溶液基本穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一樣品，平行制備5份供試品溶液，按上述色譜條件測定，計(jì)算芹菜素的含量分別為0.944mg/g， 0.936mg/g， 0.932mg/g， 0.942mg/g，0.946mg/g，平均值 0.94mg/g，RSD(%)=0.62%。表明方法的重現(xiàn)性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知芹菜素含量的樣品6份，分別精密加入一定量的對(duì)照品，按樣品測定方法處理并測定，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見表1。芹菜素的平均加樣回收率98.91%，RSD(%)=1.07%。表明測定方法準(zhǔn)確、可靠。

表1 芹菜素含量測定加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.9 樣品測定 取過三號(hào)篩的樣品粉末1g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚(60～90℃)100ml，回流提取至提取液無色，棄去溶劑，藥渣揮干石油醚，加甲醇100ml回流提取2h，濾過，提取液水浴蒸干，殘?jiān)芗尤爰状迹?5%HCL溶液(4:1)混合液25ml，稱重，加熱回流30min，放冷，用甲醇補(bǔ)足損失的重量，濾過，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按上述色譜條件，分別精密吸取對(duì)照品和供試品溶液各10μl，測定，計(jì)算。結(jié)果見圖1，表2。

圖1 芹菜素含量測定高效液相色譜圖

表2 浮萍中芹菜素含量測定結(jié)果(n=3)

3 討論與小結(jié)

3.1 由于浮萍中成分復(fù)雜，含有脂肪酸、葉綠素等脂溶性組分干擾芹菜素的測定，因此對(duì)樣品先進(jìn)行了脫脂處理。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道［4］，芹菜素在浮萍中主要以苷的形式存在，因此將樣品水解以后進(jìn)行測定。供試品溶液制備過程中對(duì)提取時(shí)間進(jìn)行了比較，提取2h以后，延長提取時(shí)間，測得芹菜素含量不再增加，故確定提取時(shí)間為 2h。水解時(shí)間比較了 10min、20min、30min、40min，結(jié)果表明，水解30min測得芹菜素含量最高，故確定水解時(shí)間為30min。

3.2 HPLC法測定浮萍中芹菜素的含量，操作簡便、準(zhǔn)確、靈敏度高，通過穩(wěn)定性、重復(fù)性、加樣回收率等方法學(xué)考察表明，符合含量測定的要求。建議《中國藥典》中增加浮萍的含量測定項(xiàng)，以更好的控制藥材的質(zhì)量。

［1］周菁，王伯初，王陽.浮萍多糖總糖含量測定與評(píng)價(jià)［J］.重慶大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，28(10):71 －72.

［2］陳桂榮，羅集鵬.浮萍的本草考證與紫外光譜法鑒別［J］.中藥材，2005，28(6):18 －19.

［3］胡本祥，鄭俊華，楊樹榮.浮萍的生藥形態(tài)及組織學(xué)研究［J］.陜西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2002，25(3):31 －32.

［4］凌云，何板作，鮑燕燕，等.浮萍的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，1999，30(2):24－26.