劉文龍 黃余燕

三高調(diào)和丸由丹參、三七、天花粉、澤瀉、甘草等組成，其功效為活血消瘀、消食化積、清熱生津、扶正驅(qū)邪。適用于高血壓、高血脂、糖尿病、及脈管炎等癥。此次試驗(yàn)的目的是完善三高調(diào)和丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，薄層色譜法(TCL)對處方中的丹參、三七這兩種主要藥材進(jìn)行定性鑒別，并采用用高效液相色譜法(HPLC)測定丹參含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1100高效液相色譜儀。

1.2 試藥 硅膠G由青島海洋化工有限公司提供批號：080222丹參酮ⅡA對照品(批號：110766-200518，中國藥品生物制品檢驗(yàn)所)。甲醇為色譜純，水為超純水，其他試劑均為分析純。三高調(diào)和丸的制備：三高調(diào)和丸為嘉應(yīng)學(xué)院醫(yī)學(xué)院制劑室生產(chǎn)(生產(chǎn)批號：20081118；20081125；20081129)

2 方法與結(jié)果

2.1 薄層鑒別

2.1.1 丹參的鑒別

2.1.1.1 供試品溶液的制備 取本品研細(xì)，稱取細(xì)粉10 g，加乙醚30 ml，超聲處理10 min，振搖，放置1 h，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? ml使溶解，作為供試品溶液。

2.1.1.2 對照品溶液的制備 另取丹參對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。再取丹參酮ⅡA對照品，加乙酸乙酯制成2 mg/ml的溶液，作為對照品溶液。

2.1.1.3 陰性對照溶液的制備：取相當(dāng)于樣品量10 g的缺丹參陰性對照樣品，按上述供試品溶液制備方法制備丹參陰性對照溶液。

2.1.1.4 薄層色譜分析 照薄層色譜法(《中國藥典》(2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn)［1］，吸取上述三種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以苯-乙酸乙酯(19：1)為展開劑，展開，取出，晾干。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上顯相同的暗紅色斑點(diǎn)，并且丹參陰性對照未出現(xiàn)斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。

圖1

2.1.2 三七的鑒別

2.1.2.1 供試品溶液的制備 取本品研細(xì)，稱取細(xì)粉10 g，加水10 ml使其潤濕，攪勻，再加水飽和的正丁醇30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液用正丁醇飽和的水洗滌3次，每次10 ml，棄去水層，取正丁醇提取液，蒸干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液

2.1.2.2 對照品溶液的制備 另取三七對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。再取三七皂苷R1對照品及人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1對照品，加甲醇制成每1 ml各含1 mg的混合溶液，作為對照品溶液。

2.1.2.3 陰性對照溶液的制備 取相當(dāng)于樣品量10 g的缺三七陰性對照樣品，按上述供試品溶液制備方法制備三七陰性對照溶液。

2.1.2.4 薄層色譜分析 照薄層色譜法(《中國藥典》(2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn)［1］，吸取上述三種溶液各2 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷-乙酸乙酯－甲醇－水(15∶40∶22∶10)10℃以下放置的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以硫酸乙醇液(1→10)，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材和對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，并且三七陰性對照未出現(xiàn)斑點(diǎn)。結(jié)果見圖2。

圖2

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱：Agilent ZORBAX C18 柱(250 mm ×4.6 mm，5μm)；流動相：甲醇-水(73∶27)；檢測波長：270nm；柱溫：30℃；理論板數(shù)按丹參酮ⅡA峰計(jì)算應(yīng)不低于2000，進(jìn)樣量10 μl。該條件丹參酮ⅡA分離度好，丹參陰性對照無干擾［2］。色譜圖見圖3。

2.2.2 對照品溶液的制備 取丹參酮ⅡA對照品約10 mg，精密稱定，置50 ml棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 ml含40 μg的溶液，即得［3］。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品適量研細(xì)，取約1 g，精密稱定，置具塞棕色瓶中，精密加入甲醇25 ml，密塞，稱定重量，超聲處理(功率205W，頻率33kHz)15 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，置棕色瓶中，即得［4-6］。

2.2.4 陰性對照溶液的制備 取相當(dāng)于供試品量1 g的缺丹參陰性對照樣品，同法制成丹參陰性對照溶液。

2.2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對照品溶液1、2、5、10、15、20 μl，依次進(jìn)樣測定。以質(zhì)量Y為縱坐標(biāo)，峰面積X為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并進(jìn)行線性回歸。其回歸方程和相關(guān)系數(shù)為：Y=227.22X+1.3829，r=0.9999，丹參酮ⅡA在0.04032～0.8064 μg范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份對照品溶液10 μl，重復(fù)測定6次，丹參酮ⅡA的峰面積RSD為0.55%。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品(20081129)6份，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，精密吸取10 μl進(jìn)樣，測得樣品中丹參酮ⅡA平均含量0.52，RSD為0.74%。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一份樣品溶液10 μl，分別0、2、4、6、8、10 h 測定，RSD 為 0.59%，說明被測溶液在 10 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.8 加樣回收試驗(yàn) 取已知含量三高調(diào)和丸的樣品粉末約0.5 g，精密稱取共6份，置棕色瓶中，分別精密加入丹參酮ⅡA對照品溶液25 ml，按2.2.3項(xiàng)下方法制備，分別測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

2.2.9 樣品測定 取三高調(diào)和丸樣品3批，按2.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按上述色譜條件測定。結(jié)果見表2。

圖3 HPLC色譜圖

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

表2 樣品測定結(jié)果

4 討論

4.1 丹參和三七的薄層色譜鑒別操作簡單，結(jié)果斑點(diǎn)對應(yīng)性好，陰性對照均無干擾，具有專屬性。在不同溫度10℃、20℃、30℃及不同濕度，不用同廠家硅膠G薄層板實(shí)驗(yàn)結(jié)果均一致。

4.2 定量測定參照《中國藥典》2010年版一部復(fù)方丹參片的方法，簡便準(zhǔn)確。實(shí)驗(yàn)中考察了超聲提取時間5、10、15、30 min的提取效果，結(jié)果3個超聲提取時間含量測定結(jié)果基本一致，為保證提取完全同時節(jié)省實(shí)驗(yàn)時間，最后選擇超聲時間為15 min。

［1］ 國家藥典委員會．中國藥典(一部)．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄ⅥB．

［2］ 張英鋒，王燕革，馬子川，等．丹參活性化學(xué)成分的研究．化學(xué)世界，2009，50(10)

［3］ 邱麗麗，容蓉，蔣海強(qiáng)，等．高效液相色譜法同時測定丹參提取物中4種成分的含量．分析試驗(yàn)室，2009，28(21)．

［4］ 藍(lán)天鳳．丹參中丹參酮類成分及其含量測定方法研究．山東中醫(yī)藥大學(xué)，2011．

［5］ 楊東風(fēng)．丹參藥材HPLC指紋圖譜及其質(zhì)量評價研究．西北農(nóng)林科技大學(xué)，2007．

［6］ 曹冬．中藥丹參及其制劑的質(zhì)量控制方法研究．河北醫(yī)科大學(xué)，2006．