陳爽 趙清來(lái)

凡是由各種因素引起的晶狀體混濁均稱為白內(nèi)障，是全世界致盲的主要原因，其中最常見(jiàn)的就是老年性白內(nèi)障，年齡越大發(fā)病率越高，但它的發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是一種進(jìn)化上高度保守的細(xì)胞應(yīng)激蛋白，可以保護(hù)機(jī)體在嚴(yán)酷的環(huán)境下得以生存。近年來(lái)，HSPs的表達(dá)與疾病的關(guān)系一直被人們所關(guān)注，其在晶狀體上皮細(xì)胞中表達(dá)的特點(diǎn)也成為眼科界研究的一大熱點(diǎn)。為探討HSP27、HSP70在老年性白內(nèi)障的形成中是否存在作用，我們利用免疫組化方法觀察晶狀體上皮細(xì)胞中HSP27、HSP70的表達(dá)特點(diǎn)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 病例資料 隨機(jī)收集2007～2010年本院住院確診為老年性白內(nèi)障行小切口白內(nèi)障超乳手術(shù)患者102例，男性48例，女性54例，年齡53～88歲，平均(73.55±8.24)歲，其中皮質(zhì)型36例，核型35例，后囊下型31例。病例均排除高度近視，葡萄膜炎，眼底病變等眼科其他疾病及糖尿病等影響晶狀體代謝的全身性疾病。對(duì)照組取自健康尸體眼晶狀體前囊膜5例，為青壯年。

1.2 晶狀體前囊膜的采集及保存 撕取晶狀體中央前囊膜，用生理鹽水干凈后，置于40 g/L多聚甲醛中固定，石蠟包埋，-25℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 HSP27、HSP70免疫組織化學(xué)觀察

1.3.1 試劑 一抗：鼠抗人HSP27單克隆單體(1：100稀釋)；鼠抗人HSP70單克隆單體(1：80稀釋)；二抗：Envision試劑；DAB顯色劑及Envision免疫組織化學(xué)試劑盒；PBS和TBS緩沖液。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)步驟 取組織蠟塊制成石蠟切塊平鋪于涂有APES的載玻片上，58℃烤24 h，二甲苯脫蠟，乙醇水化。PBS浸泡3 min×3次，3%H2O2室溫孵育5～10 min。PBS浸泡3 min×3次，將切片置于0.01 molCB液中，98℃微波修復(fù)10 min，自然冷卻至室溫。PBS浸泡3 min×3次，加正常血清封閉，室溫作用15 min。傾去多余水分，勿洗。加適量稀釋的一抗，37℃水浴1～2 h。PBS浸泡3 min×3次，加 Envision試劑，37℃水浴10～15 min。PBS浸泡3 min×3次，DAB顯色劑顯色。自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片。

1.3.3 標(biāo)本檢測(cè) 用已知陽(yáng)性標(biāo)本作陽(yáng)性對(duì)照，用PBS代替一抗，結(jié)果應(yīng)為陰性。陽(yáng)性為細(xì)胞核/漿著染為棕黃色或棕褐色，并呈顆粒狀彌漫分布。每張切片隨機(jī)觀察5個(gè)視野，并記錄陽(yáng)性細(xì)胞率。陽(yáng)性細(xì)胞率為5個(gè)視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比。陽(yáng)性細(xì)胞的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：-陰性；+陽(yáng)性細(xì)胞＜5%；++陽(yáng)性細(xì)胞5% ～25%；+++陽(yáng)性細(xì)胞25% ～50%；++++陽(yáng)性細(xì)胞50% ～75%；+++++陽(yáng)性細(xì)胞＞75%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 11.0軟件，以秩和檢驗(yàn)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

老年性白內(nèi)障與正常晶狀體上皮中均有HSP27、HSP70的表達(dá)，但各不相同。

HSP27在正常對(duì)照組晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)為(28.40±4.05)%，而在老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)：皮質(zhì)型為(76.17±2.38)%，核型為(65.83±1.76)%，后囊下型為(57.71±2.15)%，三者與正常對(duì)照組相比均有顯著性差異。且三者間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即HSP27的表達(dá)皮質(zhì)型組＞核型組＞后囊下型組。見(jiàn)表1。

表1 HSP27在晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)(n)

HSP70在正常對(duì)照組晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)為(29.60±4.95)%，而在老年性白內(nèi)障晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)：皮質(zhì)型為(77.31±2.74)%，核型為(63.26±1.76)%，后囊下型為(57.23±2.23)%，三者與正常對(duì)照組相比均有顯著性差異。且三者間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，即HSP70的表達(dá)皮質(zhì)型組＞核型組＞后囊下型組。見(jiàn)表2。

表2 HSP70在晶狀體上皮細(xì)胞中的表達(dá)(n)

3 討論

所謂白內(nèi)障是晶狀體老化后的退行性變，是多種因素作用的結(jié)果。晶狀體作為身體中蛋白質(zhì)含量最高的器官，以重量計(jì)可高達(dá)濕重的35%，而晶狀體的干重幾乎全為蛋白質(zhì)［1］。因此分析晶狀體蛋白質(zhì)的變化，是探討白內(nèi)障的形成機(jī)制的一大方向。

熱休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是生物體在不良環(huán)境因素作用下所產(chǎn)生的一組具有高度保守性的特殊蛋白，而且除了因熱刺激而產(chǎn)生以外，還有很多因素，如重金屬、缺氧、病毒或細(xì)菌感染等，都可以誘導(dǎo)其產(chǎn)生，因此也有人稱之為應(yīng)激蛋白［2］。它普遍存在于整個(gè)生物界，幾乎所有的細(xì)胞均能合成HSPs，從而參與細(xì)胞的損傷與修復(fù)。Arrigo等［3］發(fā)現(xiàn)，衰老細(xì)胞中HSP27的表達(dá)量較高，它對(duì)過(guò)量自由基產(chǎn)生的蛋白氧化，脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA損傷都有抑制作用。Li等［4］發(fā)現(xiàn)，HSP70通過(guò)抑制線粒體細(xì)胞色素 C的釋放及Caspase 3的活化來(lái)抑制細(xì)胞凋亡。在應(yīng)激狀態(tài)下，HSP27、HSP70的表達(dá)增加發(fā)揮了細(xì)胞保護(hù)，分子伴侶，信號(hào)傳導(dǎo)，凋亡調(diào)節(jié)等作用，增強(qiáng)了細(xì)胞的耐受能力。

近年來(lái)的研究表明，晶狀體能表達(dá)一系列的熱休克蛋白，它們對(duì)維持晶狀體的穩(wěn)定和透明起到關(guān)鍵作用［5］。本實(shí)驗(yàn)采用免疫組織化學(xué)染色觀察晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞中HSP27、HSP70的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)老年性白內(nèi)障中 HSP27、HSP70的含量均高于正常對(duì)照組，HSP27、HSP70的表達(dá)增加有利于阻止蛋白間不必要的相互作用，幫助變性蛋白重新折疊，維持了晶狀體蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象，從而延緩了白內(nèi)障的發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)比較皮質(zhì)型、核型、后囊下型晶狀體前囊膜上皮細(xì)胞中HSP27、HSP70的表達(dá)，還發(fā)現(xiàn)各型之間存在顯著差異，其中皮質(zhì)型HSP27、HSP70的表達(dá)＞核型＞后囊下型，故推測(cè)這三型白內(nèi)障的發(fā)生機(jī)制可能不同，HSP27、HSP70蛋白在皮質(zhì)型白內(nèi)障發(fā)生機(jī)制中作用較強(qiáng)，而在后囊下型作用較弱，其具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

總之，我們可以從熱休克蛋白具有抗氧化，分子伴侶，細(xì)胞保護(hù)等作用入手，探討HSP27、HSP70在老年性白內(nèi)障發(fā)生機(jī)制中的保護(hù)作用，為白內(nèi)障的防治工作提供新視野。

［1］ 劉家琦，李鳳鳴，吳靜安，等．實(shí)用眼科學(xué)．第二版，北京：人民衛(wèi)生出版社，2003：383-404.

［2］ Fuller KJ，Issels RD，Slosman DO，Guillet JG，Soussi T，Polla BS．Cancer and the heat shock response．EurJ Cancer，1994；30A(12)：1884-1891.

［3］ Arrigo AP，Ducasse C．Expression of the anti-apoptotic protein HSP27 during both the keratinocyte differentiation and dedifferentiation of HaCat cells：expression linked to changes in intracellular protein organization．Exp Gerontol，2002；37(10-11)：1247-1255.

［4］ Li CY，Lee JS，Ko YG．Heat shock protein 70 inhibits apoptosis downstream of cytochrome C release and upstream of Caspase 3 activation．J Biol Chem，2000；275(5)：25665-25671.

［5］ Berry Y．Alpha-B crystalline gene(CRYAB)mutation causes dominant congenital posterior polar cataract in human．Am J Hum Genet，2001；69：1141-1152．