易剛強(qiáng)，蔣孟良*，魯耀邦，劉朝暉，鐘振平，羅躍龍

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.藥圣堂制藥有限公司，湖南 安鄉(xiāng) 415600)

中藥工業(yè)

山藥中尿囊素最佳提取方法的優(yōu)選△

易剛強(qiáng)1，蔣孟良1*，魯耀邦1，劉朝暉2，鐘振平2，羅躍龍1

(1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208；2.藥圣堂制藥有限公司，湖南 安鄉(xiāng) 415600)

目的：優(yōu)選尿囊素最佳提取方法。方法：以尿囊素含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用高效液相色譜法測(cè)定20%乙醇與甲醇超聲提取、20%乙醇與甲醇回流提取及水提法樣品中尿囊素的含量。結(jié)果：提取的尿囊素含量由高到低順序?yàn)榧状汲曁崛?次>20%乙醇超聲2次>甲醇超聲1次>20%乙醇超聲1次>甲醇回流1次>20%乙醇回流1次>水回流1次。結(jié)論：尿囊素以甲醇超聲提取2次含量最高。

山藥；尿囊素；提取方法；高效液相色譜；含量測(cè)定

山藥為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖。具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、生津益肺、補(bǔ)腎澀精的作用。用于脾虛食少，久瀉不止，肺虛喘咳，腎虛遺精，帶下，尿頻，虛熱消渴[1]。山藥是應(yīng)用非常廣泛、用量非常大的藥食兩用品種。山藥中尿囊素具有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、加快傷口愈合、軟化角質(zhì)蛋白等生理功能，是皮膚創(chuàng)傷的良好愈合劑和抗?jié)兯巹2]；它還是糖尿病、肝硬化及癌癥治療藥物的重要成分[2]。為了盡量多地提出山藥中尿囊素有效成分，實(shí)驗(yàn)以尿囊素的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，優(yōu)選其最佳提取方法。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑

山藥經(jīng)湖南省藥品檢驗(yàn)所方石林主任藥師鑒定為薯蕷科植物薯蕷DioscoreaoppositaThunb.的干燥根莖；尿囊素(供含量測(cè)定用，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111501-201003)；甲醇(高效液相色譜淋洗劑，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：T20111213)；無(wú)水乙醇(分析純，安徽安特生物化學(xué)有限公司，乙醇含量≥99.7%，批號(hào)：T20110928)。

1.2 儀器

Agilent1200型高效液相色譜儀(包括紫外可見(jiàn)分光光度檢測(cè)器，美國(guó))；AB135-S型電子天平(0.01 mg，METTLER TOLEDO)；KL-UP-Ⅲ-20型艾柯超純水機(jī)(成都唐氏康寧科技發(fā)展有限公司)；SK3300H型超聲波清洗機(jī)(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；DK-S22型電熱恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司)。

2 方法

2.1 山藥的不同提取方法

2.1.1 超聲提取法 取山藥細(xì)粉約1 g，4份，精密稱(chēng)定，第1份與第2份均加入20%乙醇50.0 mL，第3份與第4份加入甲醇50.0 mL，稱(chēng)重。第1份與第3份分別超聲2次，每次30 min，兩次之間間隔30 min；第2份與第4份分別超聲1次(30 min)。超聲完畢之后擦干瓶外側(cè)的水，稱(chēng)重，用溶媒補(bǔ)足至原重，搖勻，即得。

2.1.2 回流提取法 取山藥細(xì)粉約1 g，2份，精密稱(chēng)定，置燒瓶中，分別加入甲醇與20%乙醇各50.0 mL，置水浴中回流30 min，冷卻之后擦干燒瓶外側(cè)的水，稱(chēng)重，用溶媒補(bǔ)足至原重，搖勻，即得。

2.1.3 水提取法 取山藥細(xì)粉約1 g，精密稱(chēng)定，置燒瓶中，加蒸餾水50.0 mL，置水浴中回流30 min，冷卻之后擦干燒瓶外側(cè)的水，稱(chēng)重，用水補(bǔ)足至原重，搖勻，即得。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為ODS-C18柱，流動(dòng)相為甲醇-水(5∶95)，流速為0.8 mL·min-1，柱溫為30 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為224 nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取尿囊素對(duì)照品10.20 mg，置10 mL量瓶中，加蒸餾水至刻度，精密吸取1.0 mL于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻作為對(duì)照品溶液(0.102 mg·mL-1)。

2.2.3 供試品溶液的制備 分別精密吸取2.1項(xiàng)下的各提取液10.0 mL，置小蒸發(fā)皿中，水浴上蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相適量使溶解，轉(zhuǎn)移至10.0 mL量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，即得。再用針頭式濾器(具0.45 μm微孔濾膜)濾過(guò)，備測(cè)。

2.2.4 線(xiàn)性關(guān)系的考察 精密吸取對(duì)照品溶液2，4，8，15，20 μL，分別注入高效液相儀中，照上述色譜條件分析，以尿囊素質(zhì)量X(μg)為自變量，峰面積積分值Y為因變量進(jìn)行線(xiàn)性回歸，求得回歸方程Y=342.09X+16.18，r=0.999 6，實(shí)驗(yàn)表明尿囊素在0.204～2.04 μg線(xiàn)性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液10 μL，重復(fù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，尿囊素的平均峰面積為982.6，RSD=0.97%，表明儀器的精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液10 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，其平均峰面積積分值為977.9，RSD=1.03%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批山藥細(xì)粉約1 g，精密稱(chēng)定，加甲醇50 mL超聲2次，每次30 min，再按2.2.3方法制備供試液，平行制備6份，分別精密進(jìn)樣10 μL，用外標(biāo)法計(jì)算尿囊素含量，RSD=2.4%。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含量(3.12 mg·g-1)的山藥細(xì)粉約0.5 g，6份，精密稱(chēng)定，分別加入0.75 mg·mL-1的尿囊素2.0 mL，再加入甲醇50.0 mL，稱(chēng)重，分別超聲提取2次，每次30 min，兩次之間間隔30 min，超聲完畢之后擦干瓶外側(cè)的水，稱(chēng)重，用溶媒補(bǔ)足至原重，搖勻，分別精密吸取各提取液10.0 mL，置小蒸發(fā)皿中，水浴上蒸干，殘?jiān)恿鲃?dòng)相適量使溶解，轉(zhuǎn)移至10.0 mL量瓶中，加流動(dòng)相至刻度，搖勻，再用具0.45 μm微孔濾膜的針頭式濾器濾過(guò)，取濾液依法測(cè)定，并計(jì)算回收率，結(jié)果表明，該方法回收率良好。見(jiàn)表1。

2.2.9 樣品測(cè)定 分別精密吸取尿囊素對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀中，依法測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果見(jiàn)表2、色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)

表2 不同提取方法尿囊素的含量(n=3)

結(jié)果表明，用甲醇超聲提取2次，每次30 min，含量最高，其次為20%乙醇超聲2次及甲醇超聲1次，再次為20%乙醇超聲1次與甲醇回流1次，20%乙醇與水回流含量最低。

A.尿囊素 B.山藥圖1 尿囊素對(duì)照品及山藥HPLC圖

3 小結(jié)與討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，不同提取方法的山藥中尿囊素含量順序是：甲醇超聲提取2次>20%乙醇超聲2次>甲醇超聲1次>20%乙醇超聲1次>甲醇回流1次>20%乙醇回流1次>水回流1次。從提取方法來(lái)看，超聲優(yōu)于回流；從溶媒來(lái)看，甲醇優(yōu)于20%乙醇，水最差，這可能是在樣品處理時(shí)甲醇沸點(diǎn)低，受熱影響少而破壞少，而水的沸點(diǎn)最高，受熱影響大而破壞多，20%乙醇在二者之間；從提取次數(shù)來(lái)看，以提取2次為佳，增加了近11個(gè)百分點(diǎn)，故尿囊素的提取采用甲醇超聲提取2次。

據(jù)報(bào)道，HPLC法測(cè)定尿囊素含量的流動(dòng)相有用甲醇-水(1∶9)[3-5]，本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其分離效果并不好，其分離度不能達(dá)到分析要求；采用甲醇-磷酸二氫鉀緩沖液(2∶98)[6-8]雖然分離效果更好，但此種比例的極性太大；還有采用純水的[9-10]，這對(duì)色譜柱的損害較大。經(jīng)摸索最后采用甲醇-水(5∶95)作為流動(dòng)相，基本能夠達(dá)到較好的分離效果，尿囊素出峰的時(shí)間大約在3.8 min左右。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[11]，尿囊素在堿性條件下不穩(wěn)定，水解成脲、乙醛酸和尿囊素酸，因此稀對(duì)照品溶液及樣品溶液最好在用前準(zhǔn)備。

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OptimizationofExtractionMethodofAllantoininYam

YI Gang-qiang1，JIANG Meng-liang1*，LU Yao-bang1，LIU Zhao-hui2，ZHONG Zhen-ping2，LUO Yue-long1

(1.HunanUniversityofChineseMedicine，Changsha410208，China；2.YaoshengtangManufactureDrugCorporation，Anxiang415600，China)

Objective：To optimize allantoin extraction method fromDioscoreaoppositaThunb.Methods：Using allantoin content as the indexes，20% ethanol and methanol ultrasonic extraction，20% ethanol and methanol reflux extraction and water formulation samples were determined by HPLC.Results：The allantoin content：Methanol ultrasonic extraction 2 times>20% ethanol ultrasonic 2 times>methanol ultrasonic 1 time>20% ethanol ultrasonic 1 time>methanol reflux 1 time>20% ethanol reflux 1 time>water reflux 1 time.Conclusion：Methanol ultrasonic extraction 2 times has the highest allantoic content.

DioscoreaoppositaThunb.；Allantoin；Extraction methods；HPLC；Content determination

2013-02-05)

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產(chǎn)學(xué)研校企合作項(xiàng)目(YXY2010-002)

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蔣孟良，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事中藥炮制與制劑研究，E-mail：hhjml@163.com