陳明權(quán)，黃海波，趙徑華

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

不同產(chǎn)地猴耳環(huán)總黃酮含量比較研究△

陳明權(quán)，黃海波*，趙徑華

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

目的：測定不同產(chǎn)地猴耳環(huán)藥材中的總黃酮含量。方法：以蘆丁為對照品，三氯化鋁(AlCl3)比色，采用紫外可見分光光度法(UV)測定樣品總黃酮含量，檢測波長406 nm。結(jié)果：總黃酮在5.09～50.90 μg·mL-1線性關(guān)系良好，回歸方程為Y=0.026 7X+0.007 2，r=0.999 1；平均加樣回收率為101.23%，RSD=1.93%(n=6)。結(jié)論：AlCl3比色法準(zhǔn)確、簡便，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，可用于猴耳環(huán)藥材中總黃酮的含量測定；不同產(chǎn)地猴耳環(huán)中總黃酮的含量存在一定的差異。

猴耳環(huán)；總黃酮；含量測定

猴耳環(huán)藥材來源于豆科含羞草亞科圍涎樹屬植物猴耳環(huán)PithecellobiumclypeariaBenth.的干燥幼枝及葉，味苦、澀,性寒，具清熱解毒、收濕斂瘡功效，是治療多種熱毒癥獨(dú)特的南藥[1]。現(xiàn)代臨床主要用于治療上呼吸道感染、急性胃腸炎、急性咽喉炎、急性扁桃體炎[2-4]；亦有明顯的抗流感病毒作用，其中黃酮類成分為其主要成分之一[5]。然而，有關(guān)猴耳環(huán)中總黃酮的含量測定方法尚未見報道。實(shí)驗(yàn)通過紫外分光光度法測定不同產(chǎn)地猴耳環(huán)藥材中總黃酮的含量，為建立猴耳環(huán)較完善的質(zhì)量評價體系提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

CARY 50 Probe紫外-分光光度計(美國瓦里安)；SCQ320ID超聲波清洗儀(上海聲彥超聲儀器)；BP211D電子天平(德國賽多利斯)；DXF-10A粉碎機(jī)(廣州市大祥電子機(jī)械設(shè)備)；800B離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器)。

1.2 材料

9批猴耳環(huán)藥材采集時間與地點(diǎn)，見表1，經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室黃海波副教授鑒定為猴耳環(huán)PithecellobiumclypeariaBenth.的干燥幼枝及葉，標(biāo)本存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)；蘆丁對照品(批號：100080，中國食品藥品檢定研究院)；水為蒸餾水；其他試劑均為分析純。

表1 猴耳環(huán)藥材樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品溶液的制備

精密稱取經(jīng)五氧化二磷干燥至恒重的蘆丁對照品5.09 mg，置于50 mL量瓶中，加70%乙醇適量，超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻，得對照品溶液(0.101 8 mg·mL-1)。

2.2 測定波長的選擇

精密量取2.0 mL蘆丁對照品溶液，于10 mL 量瓶中，分別加入0.1 mol·L-1AlCl3溶液(用70%乙醇配制)2 mL，搖勻，放置 6 min；加入pH 5.2的NaAc-HAc緩沖溶液1 mL，以70%乙醇稀釋至刻度，并在水浴40 ℃加熱15 min。以相應(yīng)的試劑溶液作參比，按紫外分光光度法[6]，在350～600 nm掃描，結(jié)果表明蘆丁對照品溶液在406 nm處有最大吸收，因此選擇406 nm為測定波長。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取對照品溶液0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL分別置于10 mL 容量瓶中，分別加入0.1 mol·L-1AlCl3溶液2 mL，搖勻，放置6 min；加入pH 5.2的NaAc-HAc緩沖溶液1 mL，以70%乙醇稀釋至刻度，并在水浴40 ℃加熱15 min，以相應(yīng)的試劑溶液作空白，測定吸光度。并以吸光度為縱坐標(biāo)(Y)，濃度(μg·mL-1)為橫坐標(biāo)(X)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程為：Y=0.026 7X+0.007 2，r=0.999 1(n=6)。

2.4 供試品溶液的制備

精密稱取各產(chǎn)地猴耳環(huán)細(xì)粉約1.00 g，置入100 mL錐形瓶中，精密加入70%乙醇30 mL，立即蓋上瓶塞，稱定重量，超聲處理40 min，冷卻，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，離心(2 000 r·min-1，10 min)，過濾，取續(xù)濾液作為猴耳環(huán)供試品溶液。

2.5 精密度試驗(yàn)

精密吸取2 mL蘆丁對照品溶液，按2.3項(xiàng)下方法測定吸光度，連續(xù)測定6次；所測結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算濃度，其均值為20.26 μg·mL-1，RSD=0.23%(n=6)，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取猴耳環(huán)樣品平行操作6份(廣東羅定樣品)，精密量取0.2 mL供試品溶液于10 mL量瓶中，按2.3項(xiàng)下方法測定吸光度，計算猴耳環(huán)總黃酮的含量。結(jié)果求得其RSD=1.47%(n=6)。表明方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取猴耳環(huán)供試品溶液(廣東羅定樣品)，精密量取0.2 mL供試液于10 mL量瓶中，按2.3項(xiàng)方法，分別在10，20，30，40，50，60 min 測定吸光度，所測結(jié)果代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算濃度，求得其RSD=1.43%(n=6)，表明供試品溶液在60 min內(nèi)顯色基本穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗(yàn)

取同一批已知含量的供試品(廣東羅定樣品，總黃酮含量為0.96%)6份，精密稱量約0.50 g，加入一定量蘆丁對照品，按2.3項(xiàng)下方法操作；取本品的供試液0.2 mL置10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，作參比，測定吸光度，計算回收率，結(jié)果見表2，表明氯化鋁比色法的加樣回收率良好。

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.9 樣品含量測定

精密吸取上述各產(chǎn)地供試液0.2 mL，置于10 mL量瓶中，按2.3項(xiàng)下方法操作；取本品的供試液0.2 mL置10 mL量瓶中，加70%乙醇至刻度，搖勻，作參比，在406 nm波長處測定吸光度。求各產(chǎn)地猴耳環(huán)中總黃酮的含量，結(jié)果見表3。

表3 不同產(chǎn)地猴耳環(huán)中總黃酮的含量測定結(jié)果(n=3)

結(jié)果表明，不同產(chǎn)地總黃酮含量大小依次為：海南尖峰嶺>海南霸王嶺>廣東惠東>廣東從化>云南西雙版納>廣東新興>廣西百色>廣東羅定>廣東信宜，經(jīng)統(tǒng)計分析，各產(chǎn)地猴耳環(huán)藥材中總黃酮含量存在顯著差異。海南尖峰嶺猴耳環(huán)藥材總黃酮含量最高，達(dá)2.39%；廣東信宜猴耳環(huán)藥材總黃酮含量最低，僅為0.36%。

3 討論

關(guān)于總黃酮的測定方法報道較多，一般采用比色法、高效液相色譜法。比色法以NaNO2-A1(NO3)3-NaOH比色法常用[7]，郭亞建等[8]曾對這種方法的專屬性進(jìn)行了討論，發(fā)現(xiàn)有些黃酮類物質(zhì)在500 nm處無最大吸收或吸收很弱，而有些具有鄰二酚羥基的非黃酮類物質(zhì)在500 nm處有最大吸收或有較強(qiáng)吸收。而猴耳環(huán)藥材中所含有機(jī)酸成分均具有鄰二酚羥基[5，9]，因此，使用該方法測定結(jié)果的專屬性不強(qiáng)，有局限性。據(jù)文獻(xiàn)報道[10]，AlCl3比色法主要是依據(jù)具有3-羥基、4-羰基或5-羥基、4-羰基的黃酮與Al3+形成配合物使吸收峰紅移的性質(zhì)，測定總黃酮含量；猴耳環(huán)藥材中的3種黃酮均具有發(fā)生該反應(yīng)的結(jié)構(gòu)，故采用三氯化鋁比色法測定猴耳環(huán)藥材中總黃酮含量具有相對較強(qiáng)的專屬性。

實(shí)驗(yàn)選擇了專屬性較強(qiáng)的AlCl3比色方法，方法學(xué)考察試驗(yàn)顯示該法穩(wěn)定性好、重現(xiàn)性好、精密度高、回收率好?？梢?，該法測定總黃酮含量，操作簡單方便，結(jié)果比較準(zhǔn)確，既可用于猴耳環(huán)藥材的質(zhì)量控，又可為其進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

[1] 陳元勝，葉永才.廣東省中藥材標(biāo)準(zhǔn)[M].第一冊.廣州：廣東科學(xué)技術(shù)出版社，2004：197-199.

[2] 蘭小玲，黃躍，楊廣林.猴耳環(huán)消炎片治療咽喉炎、扁桃腺炎200例療效觀察[J].實(shí)用臨床醫(yī)學(xué)，2007，8(2)：89-90，92.

[3] 陳洪林.猴耳環(huán)消炎顆粒治療急性咽炎52例臨床觀察[J].新余高專學(xué)報，2010，15(2)：97-98.

[4] 王家蔚，郁峰.猴耳環(huán)消炎顆粒治療急性上呼吸道感染療效觀察[J].實(shí)用中西醫(yī)結(jié)合臨床，2011，11(3)：64-65.

[5] 李藥蘭，李克明，蘇妙賢，等.猴耳環(huán)抗病毒有效成分研究[J].中國中藥雜志，2006，31(5)：397-400.

[6] 國家藥典委員會.中國藥典[S].一部.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄30-31.

[7] 馬陶陶，張群林，李俊.中藥總黃酮的含量測定方法[J].安徽醫(yī)藥，2007，11(11)：1030-1032.

[8] 郭亞健，范莉，王曉強(qiáng)，等.關(guān)于NaNO2-A1(NO3)3-NaOH比色法測定總黃酮方法的探討[J].藥物分析雜志，2002，22(2)：97-99.

[9] 郭曉宇，王乃利，寶麗等.猴耳環(huán)的化學(xué)成分及其對T淋巴細(xì)胞增殖的影響[J].中國藥學(xué)(英文版)，2007，16(3)：208-213.

[10] 馬陶陶，張群林，李俊，等.三氯化鋁比色法測定中藥總黃酮方法的探討[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19(1)：54-56.

ComparisonStudyofTotalFlavonoidsinPithecellobiumclypeariaBenthfromDifferentProducingAreas

CHEN Ming-quan，HUANG Hai-bo*，ZHAO Jing-hua

(CollegeofChineseMateriaMedica，GuangzhouUniversityofTCM，Guangzhou510006，China)

Objective：To determine the content of total flavonoids inPithecellobiumclypeariaBenth from different habitats，according to the content level to clustering analysis of it.Methods：Rutin was defined as the reference substance，using AlCl3colorimetry and UV-Vis spectrophotometry method was adopted.the detective wavelength was 406 nm.Results：Concentration of total flavonoids had a good liner relationship in the range of 5.09～50.90 μg·mL-1.The regression equation wasY=0.026 7X+ 0.007 2，r=0.999 1.The average recovery rate was 101.23% with RSD 1.93%(n=6).Conclusion：The method is simple，specific，repeatable and stable.It can be applied for the quantitative determination ofPithecellobiumclypeariaBenth.The contents of total flavonoids were significantly different in different producing areas ofPithecellobiumclypeariaBenth.

PithecellobiumclypeariaBenth；Total flavonoids；Quantitative determination

2013-06-01)

基于多學(xué)科的南藥開發(fā)利用關(guān)鍵技術(shù)集成示范研究(2012BAI29B09)

*

黃海波，副教授，主要從事中藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范化研究與中藥材GAP研究，E-mail：bobhwang65@gmail.com