金 禮 吉＊， 王 利 平， 鄒 薇， 肖 義

（大連理工大學(xué) 化工與環(huán)境生命學(xué)部，遼寧 大連 116024）

0 引 言

1973年，Brana等首次合成了一系列3－硝基單萘酰亞胺類衍生物，這類化合物被證明能有效地嵌入DNA［1］.在單萘酰亞胺類衍生物中，已經(jīng)進(jìn)入臨床實驗的藥物有米托萘胺（Mitonafide）［2］和氨萘非特（Amonafide）［3］，它們均能嵌入DNA，影響DNA和RNA的功能.20世紀(jì)80年代，人們將2個萘環(huán)用一個“手臂”連接起來，得到了具有更高細(xì)胞毒性和更強DNA結(jié)合力的雙萘酰亞胺［4］，連接基上的氨基氮原子質(zhì)子化形成的正離子有利于發(fā)生靜電作用，從而提高嵌入劑分子與DNA的親和力，適當(dāng)?shù)娜嵝院烷L度又可確保二者形成穩(wěn)定的復(fù)合物.目前處于臨床研究的雙萘酰亞胺類化合物主要有依利萘法德（Elinafide）［5］和Du Pont Merck開發(fā)的雙萘法德（Bisnafide）［6］.研究發(fā)現(xiàn)，連接基的長度、對稱性及其電負(fù)性影響雙萘酰亞胺類化合物與DNA的結(jié)合力.有關(guān)雙萘酰亞胺連接基種類的研究已成為關(guān)注熱點［7－9］，但連接基的長度與化合物活性之間的關(guān)系尚無系統(tǒng)、深入的研究.本實驗通過考察不同長度的烷基異硫脲陽離子作為連接臂的一系列新型雙萘酰亞胺類化合物與DNA的相互作用，分析連接臂的長短對雙萘酰亞胺類化合物嵌入能力的影響，以期為研究DNA與萘酰亞胺嵌入單元和連接基之間的特異性結(jié)合提供實驗和理論依據(jù)，同時也為其他各類化合物的連接基的分子設(shè)計奠定基礎(chǔ).

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

TU－1900雙光束型紫外－可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司）；日立F－4500熒光分光光度計（日本Hitachi公司）；J－810型圓二色光譜儀（日本Jasco公司）.

小牛胸腺DNA為Sigma公司產(chǎn)品，UV測得A260／A280＞1.8，表明純度符合要求，稱取一定量配成溶液，測得濃度為6.67×10－4mol／L，4℃保存；吖啶橙（AO）配制為1mol／L母液保存；Tris－HCl緩沖溶液（0.02mol／L，pH7.2）為臨時配制；實驗用水采用二次蒸餾水，其他試劑均為分析純.

本實驗中的新型雙萘酰亞胺類化合物（DN2～DN6）是由大連理工大學(xué)化工學(xué)院肖義合成的，并已取得專利［10］，合成路線如圖1所示（n＝2～6）.

合成的化合物命名為 DN2：N，N′－雙（2，2′－乙基雙萘酰亞胺）－S－甲基－異硫脲；DN3：N，N′－雙（3，3′－丙基雙萘酰亞胺）－S－甲基－異硫脲；DN4：N，N′－雙（4，4′－丁 基 雙 萘 酰 亞 胺）－S－甲 基－異 硫 脲；DN5：N，N′－雙（5，5′－戊基雙萘酰亞胺）－S－甲基－異硫脲；DN6：N，N′－雙（6，6′－己基雙萘酰亞胺）－S－甲基－異硫脲.

圖1 新型雙萘酰亞胺類化合物的合成路線Fig.1 The synthesis route for the novel bis－naphthalimide derivatives

1.2 實驗方法

1.2.1 紫外吸收光譜 在一系列10mL比色管中分別加入終濃度為10μmol／L的DN2～DN6，再加入不同體積的DNA溶液，用Tris－HCl緩沖溶液稀釋至刻度后搖勻，室溫放置15min后，以相應(yīng)的Tris－HCl緩沖溶液為參比，掃描300～400nm的紫外吸收光譜.

1.2.2 熒光光譜

（1）DNA對化合物熒光光譜的影響

在一系列10mL比色管中分別加入終濃度為10μmol／L的DN2～DN6，再加入不同體積的DNA溶液，用Tris－HCl緩沖溶液稀釋至刻度后搖勻，室溫放置15min后，以344nm為激發(fā)波長，掃描320～650nm的熒光光譜，激發(fā)與發(fā)射狹縫均為5nm，掃描速度為2 400nm／min.

（2）化合物和AO對DNA的競爭結(jié)合實驗

在一系列10mL比色管中依次加入相同體積的AO溶液、DNA溶液，用Tris－HCl緩沖溶液稀釋至刻度后搖勻，室溫放置15min后，再于上述比色管中分別加入一定體積的DN2～DN6，每次加入溶液后搖勻并放置15min，以502nm為激發(fā)波長，掃描450～750nm的熒光光譜.

1.2.3 圓二色光譜 在一系列10mL比色管中加入相同體積的DNA溶液，再分別加入一定體積的DN2～DN6，使化合物與DNA的物質(zhì)的量比分別為0.02、0.04、0.10、0.20、0.50和1.00，用 Tris－HCl緩沖溶液稀釋至刻度后搖勻并放置15min，于圓二色光譜儀上掃描220～350nm的摩爾橢圓度θ.

2 結(jié)果與討論

2.1 DNA對化合物紫外吸收光譜的影響

化合物DN2～DN6在231和343nm處有特征吸收峰（見圖2），隨著DNA的加入，化合物的吸收峰在231nm處均出現(xiàn)明顯的減色效應(yīng)，根據(jù)減色率計算公式：減色率＝（A0－A1）／A0×100%，其中A0為未加DNA時化合物的吸光度（各化合物初始濃度相同），A1為加DNA后化合物吸光度（各化合物中DNA濃度保持一致），當(dāng)DNA濃度為2.00μmol／L時，DN2～DN6的減色率分別為6.1%、16.3%、15.8%、21.7%和25.2%，且均伴有微弱的紅移現(xiàn)象，化合物DN6的減色效應(yīng)最為顯著，說明烷基鏈的長短起到了重要作用.化合物分子中的芳環(huán)平面插入到DNA堿基對之間［11］，化合物的π軌道與堿基的π軌道發(fā)生耦合，使部分電子填充進(jìn)來，導(dǎo)致π→π＊躍遷幾率減小，從而產(chǎn)生減色效應(yīng)［12］；化合物的烷基鏈越長，異硫脲基團(tuán)對其電子云的吸引力就越強，芳環(huán)共軛體系的電子云密度就越低，有助于化合物的芳環(huán)與DNA堿基平面之間發(fā)生堆積作用［13］，因此在總體變化趨勢上，化合物的減色效應(yīng)隨其烷基鏈的延長而增強.

2.2 DNA對化合物熒光光譜的影響

由熒光光譜結(jié)果可見，5種化合物均具有較強的內(nèi)源性熒光，其中DN2在400nm處有較強特征發(fā)射峰，而其他4種化合物在495nm處有較強特征發(fā)射峰（見圖3），這種差異性可能是由異硫脲基團(tuán)的電荷分布所致.隨著DNA的加入，各化合物的熒光光譜均呈現(xiàn)有規(guī)律的猝滅，這是由于化合物嵌入DNA堿基對產(chǎn)生電荷轉(zhuǎn)移，進(jìn)而改變自身激發(fā)態(tài)的電子態(tài)，導(dǎo)致熒光強度降低［14］.經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)，DNA對化合物的猝滅作用隨烷基鏈的延長而增強，這與紫外吸收光譜實驗結(jié)果相一致.

圖2 DNA對DN2～DN6的紫外吸收光譜（pH＝7.2）Fig.2 The UV absorption spectra of the DNA to DN2－DN6（pH ＝7.2）

圖3 DNA存在下DN2～DN6的熒光光譜Fig.3 The fluorescence spectra of DN2－DN6in the presence of DNA

2.3 DNA對化合物熒光的猝滅方式

熒光猝滅分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅兩類，根據(jù)經(jīng)典的熒光猝滅理論，如果猝滅是單一的靜態(tài)或動態(tài)過程，以F0／F對c（DNA）作圖將得到一條直線，若非直線，則為混合猝滅方式［15］.如圖4所示，本實驗結(jié)果均符合直線關(guān)系，說明反應(yīng)體系中只存在一種熒光體，即猝滅劑DNA和熒光體雙萘酰亞胺類化合物之間形成了不發(fā)熒光的基態(tài)絡(luò)合物，據(jù)此推斷兩者的猝滅方式不是動態(tài)猝滅，而是形成化合物－DNA復(fù)合物的靜態(tài)猝滅.根據(jù)Stern－Volmer方程［15－16］

計算得猝滅常數(shù)Ksv（DN3－DNA）＝0.46×105L／mol，Ksv（DN4－DNA）＝0.42×105L／mol，Ksv（DN5－DNA）＝1.00×105L／mol，Ksv（DN6－DNA）＝2.05×105L／mol，其中c（Q）為猝滅劑DNA的濃度.DN2的特征發(fā)射波長與其他4種化合物不一致，因此未對其進(jìn)行相關(guān)計算.

圖4 DN3～DN6的Stern－Volmer方程線性擬合Fig.4 The linear fitting of Stern－Volmer equation of DN3－DN6

雙萘酰亞胺類化合物與DNA分子中某一位點作用時，體系中發(fā)生作用的小分子與未發(fā)生作用的小分子之間處于一種平衡狀態(tài)，這種平衡狀態(tài)可以用以下方程進(jìn)行描述：

式中：n為結(jié)合位點數(shù)，K為結(jié)合常數(shù).以lg［（F0－F）／F］對lgc（Q）進(jìn)行一元線性回歸，得到線性方程（圖形見圖5），由表1可見，DN3～DN6的結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點均逐漸增大，表明烷基鏈越長的化合物與DNA的結(jié)合能力越強.

圖5 lg［（F0－F）／F］對lg c（Q）的工作曲線Fig.5 The working curve of lg［（F0 －F）／F］to lg c（Q）

2.4 化合物與AO對DNA的競爭結(jié)合實驗

如圖6所示，激發(fā)波長為502nm時，AO在534nm處有一特征吸收峰（曲線a），加入DNA后，AO的吸收峰降低（曲線b），即DNA對AO發(fā)生了猝滅作用，這是AO嵌入到DNA的堿基對中所致；隨后在AO－DNA體系中加入不同濃度的各類化合物，結(jié)果見圖6中（c）、（d），化合物在此激發(fā)波長下于505nm處出現(xiàn)了一個特征吸收峰.實驗結(jié)果表明，DN2對體系的熒光影響最小，即與AO競爭能力最弱；DN3～DN6在534 nm處的熒光強度有不同程度的上升，說明化合物能夠?qū)O－DNA體系中的AO脫離DNA堿基對，成為游離狀態(tài)，使AO的吸收峰增強.對比分析可知化合物與AO的競爭力隨烷基鏈的延長而增強，即DN6＞DN5＞DN4＞DN3＞DN2.

2.5 圓二色光譜

DNA在200～300nm有典型的B－型構(gòu)象［17］，從圓二色光譜（CD光譜）分析結(jié)果可見（見圖7），正峰表示DNA的堿基堆積程度，負(fù)峰表示DNA的螺旋松散程度.DNA的圓二色光譜在276和243nm處分別有一個正峰和負(fù)峰，DN2～DN6的加入均可引起DNA的圓二色光譜正峰的增強和負(fù)峰的減弱，表明該類化合物都能嵌入DNA分子中［18］.經(jīng)對比分析可知，化合物的正峰和負(fù)峰強度增加和減弱程度隨連接基長度的增加而上升，即DN2＜DN3＜DN4＜DN5＜DN6.由此推測，化合物嵌入DNA影響DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)和堿基堆積力，其作用強度隨烷基鏈的延長而增強.

表1 DN3～DN6對DNA的結(jié)合常數(shù)K與結(jié)合位點數(shù)nTab.1 Binding constants Kand binding sites nof the interaction between DN2－DN6and DNA

圖6 DN2～DN6對AO－DNA體系熒光光譜的影響Fig.6 The effect of DN2－DN6on the fluorescence of AO－DNA system

圖7 化合物DN2～DN6對DNA的CD光譜的影響Fig.7 The effect of DN2－DN6on the CD spectra of DNA

3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，烷基異硫脲陽離子作為連接基的新型雙萘酰亞胺類化合物主要以嵌入方式與DNA發(fā)生作用，在DN2～DN6五種化合物中，烷基鏈的長短直接影響嵌入基團(tuán)的電子云密度和化合物自身的柔性，烷基鏈越長化合物的柔性越強，對DNA的嵌入能力也越強，即DN6＞DN5＞DN4＞DN3＞DN2.

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