許揚(yáng)梅，龔福生，陳雪芳，鄭秋紅

近年研究表明，腫瘤是一種干細(xì)胞疾病，在多種實(shí)體瘤及其衍生腫瘤細(xì)胞系中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了腫瘤干細(xì)胞的存在，胃癌干細(xì)胞的研究雖進(jìn)展緩慢但逐漸受到重視［1］。Li和She等運(yùn)用Side Population（SP）法證明了不同胃癌細(xì)胞系中SP細(xì)胞的干細(xì)胞特性［2－3］。Chen等發(fā)現(xiàn)CD44陽性胃癌細(xì)胞具有干細(xì)胞特性［4］。Jiang等發(fā)現(xiàn)CD90胃癌細(xì)胞能形成懸浮細(xì)胞球，有成瘤能力，并對(duì)靶向藥物曲妥珠單抗敏感［5］。Liu發(fā)現(xiàn)胃癌懸浮細(xì)胞球具有腫瘤干細(xì)胞特征［6］。上述研究提示胃癌干細(xì)胞的存在。本實(shí)驗(yàn)采用懸浮細(xì)胞法和SP 2種方法來證明胃癌干細(xì)胞特性，并采用基因芯片技術(shù)篩選胃癌干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物，3種方法相互支持、驗(yàn)證，為胃癌干細(xì)胞的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 試劑 1640培養(yǎng)基及B27（美國Gibico公司）、10%胎牛血清（FBS）、DMEM／F12培養(yǎng)基（美國Hyclone公司），堿性成纖維細(xì)胞生長因子（bFGF，美國Peprotech公司）、表皮生長因子（EGF，美國Peprotech公司），胰島素及胰酶（美國Sigma公司），瓊脂粉（北京邦定生物公司），RFQ－PCR實(shí)驗(yàn)試劑E．Coli polyA polymerase（NEB）、M－MLV Reverse Transcriptase（美國Promega公司），SYBR?Premix Ex TaqTMII（日本Takara公司），華聯(lián)表達(dá)譜基因芯片（上?？党缮锕こ蹋?。

1．1．2 動(dòng)物 雌性NOD／SCID鼠［上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)SYXK（閩）2008－0001］，鼠齡4～5周，體質(zhì)量20～23g，自由飲食。

1．1．3 細(xì)胞株和細(xì)胞培養(yǎng) 人胃癌細(xì)胞系SGC－7901（上海細(xì)胞所）復(fù)蘇后用含10%的小牛血清1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，3d換液1次，在37℃、體積分?jǐn)?shù)為0．05的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)以0．25%胰酶消化、傳代。按照bFGF 10ng／mL、EGF 20ng／mL、B27 10μL／mL和胰島素5μg／mL的劑量，將各種生長因子加入到經(jīng)過濾除菌的DMEM／F12培養(yǎng)基中配成無血清培養(yǎng)基。胰酶消化的單細(xì)胞離心洗滌，重懸于無血清培養(yǎng)基進(jìn)行懸浮細(xì)胞球的培養(yǎng)。

1．2 方法

1．2．1 流式細(xì)胞術(shù)檢測SP側(cè)群細(xì)胞 取對(duì)數(shù)生長期的貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞球，分別制備成濃度為1×106mL－1的單細(xì)胞懸液，實(shí)驗(yàn)組加入5μg／mL的熒光染料 Hoechst33342，對(duì)照組5μg／mL加入Hoechst33342和 50μmol／L維拉帕米（Verapamil），置于37℃水浴鍋孵育90min，每隔30min震蕩混勻1次。1 200r／min低速離心，棄上清，2mL PBS重懸，400目篩網(wǎng)過濾，檢測前加碘化丙啶染色標(biāo)記死亡細(xì)胞。采用Moflo XDP高端流式細(xì)胞儀，紫外激發(fā)光檢測。Hoechst33342陰性或弱陽性為SP 細(xì) 胞，Hoechst33342 陽 性 為 Non－SP（NSP）細(xì)胞。

1．2．2 懸浮細(xì)胞球自我更新能力 以貼壁細(xì)胞作為對(duì)照組，用0．25%胰酶分別消化懸浮細(xì)胞球和貼SGC－7901細(xì)胞成單個(gè)細(xì)胞，臺(tái)盼藍(lán)染色作活細(xì)胞記數(shù)后，用無血清培養(yǎng)基分別稀釋瘤細(xì)胞懸液至103mL－1?；靹蚝?，用移液槍將兩種細(xì)胞懸液分別轉(zhuǎn)移到96孔板內(nèi)，每組各20孔，每孔100μL即平均每孔含100個(gè)細(xì)胞。每孔分別再添加100μL的無血清培養(yǎng)基，靜置培養(yǎng)。每隔2d添加25μL培養(yǎng)基，7d后記數(shù)每孔形成細(xì)胞球數(shù)。

1．2．3 NOD／SCID鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn) 0．25%胰酶消化處于對(duì)數(shù)生長期的貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞球，臺(tái)盼藍(lán)染色作活細(xì)胞記數(shù)。離心后重懸于生理鹽水中并計(jì)數(shù)，配成濃度為5×102，5×103，5×104，5×105mL－1的細(xì)胞懸液。同一批次購買的NOD／SCID鼠20只，每1個(gè)細(xì)胞濃度注射5只，在其左右腋窩皮下分別注射貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞懸液各0．2mL。觀察小鼠的生活狀況及局部腫瘤生長情況。6周后頸部脫臼處死，解剖并觀察腫瘤的數(shù)目和大小。10%福爾馬林固定腫瘤塊24h。石蠟包埋，常規(guī)切片并H－E染色。

1．2．4 基因芯片檢測 懸浮球和貼壁細(xì)胞分別提取總RNA，質(zhì)檢合格的RNA按華聯(lián)表達(dá)譜基因芯片操作要求進(jìn)行標(biāo)本預(yù)雜交、探針標(biāo)記、雜交和洗片。用ScanArray 4000掃描儀掃描圖像，GenePix－Pro 3．0圖像軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)按篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行均一化處理，計(jì)算出各基因點(diǎn)貼壁細(xì)胞與懸浮細(xì)胞球的差異表達(dá)Ratio值＝cy5cy3，以Ratio＜0．5為表達(dá)下調(diào)，0．5～2．0為非差異表達(dá)，＞2．0為表達(dá)上調(diào)。

1．2．5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 將質(zhì)檢合格的貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞球總RNA分別逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，再將兩樣品的目的基因以及管家基因進(jìn)行擴(kuò)增，其產(chǎn)物進(jìn)行梯度稀釋作標(biāo)準(zhǔn)曲線，后將標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測樣品加入到含SYBR Green熒光染料反應(yīng)體系中，在 Rotor－Gene 3000Real－time PCR儀上進(jìn)行實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增。檢測結(jié)果用管家基因進(jìn)行校正。引物序列和反應(yīng)溫度見表1。

表1 引物序列和反應(yīng)溫度Tab 1 Primer sequence and annealing temperature

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料采用±s表示，SPSS 11．5統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。P＜0．05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)胃癌SGC－7901細(xì)胞SGC－7901細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)7d后，大部分細(xì)胞死亡，小部分細(xì)胞繼續(xù)貼壁生長，（8．00±0．54）%的單個(gè)細(xì)胞可以懸浮生長并增殖形成細(xì)胞球（圖1）。

圖1 單個(gè)細(xì)胞形成的懸浮細(xì)胞球（SP ×400）Fig 1 A floating sphere formed from a single（SP ×400）

2．2 SP側(cè)群細(xì)胞檢測 流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示染料Hoechst33342加拮抗劑Verapamil組SP細(xì)胞含量明顯下降，細(xì)胞外排染料的能力被Verapamil阻滯。懸浮細(xì)胞球中SP細(xì)胞占（12．34±1．01）%，而貼壁細(xì)胞中SP占（0．62±0．05）%，即懸浮球比貼壁細(xì)胞富集SP細(xì)胞（圖2）。

2．3 懸浮球細(xì)胞自我更新 100個(gè)貼壁細(xì)胞在無血清培養(yǎng)基中可形成（9．75±1．85）個(gè)細(xì)胞球，而100個(gè)懸浮細(xì)胞球細(xì)胞形成的細(xì)胞球數(shù)則是（31．42±6．13），明顯多于貼壁細(xì)胞組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

2．4 NOD／SCID小鼠成瘤實(shí)驗(yàn) 懸浮細(xì)胞球組在1×103個(gè)細(xì)胞的注射劑量能使3只小鼠致瘤，而貼壁細(xì)胞不能致瘤。在1×105個(gè)細(xì)胞的注射劑量時(shí)，懸浮細(xì)胞球組能使5只小鼠全部致瘤，而貼壁細(xì)胞只能使2只小鼠致瘤。懸浮細(xì)胞球比貼壁細(xì)胞具有更強(qiáng)的腫瘤形成能力（表2）。

表2 NOD／SCID鼠成瘤情況Tab 2 NOD／SCID mice tumor formation

圖2 懸浮細(xì)胞球與貼壁細(xì)胞組SP含量檢測Fig 2 SP test by flow cytometry

2．5 H－E染色結(jié)果 貼壁細(xì)胞和懸浮細(xì)胞球在NOD／SCID鼠形成的腫瘤其形態(tài)學(xué)無明顯差異，兩者都可見形態(tài)異常的腫瘤細(xì)胞，核大、深染，可見病理性核分裂相。腫瘤分化程度底，但仍可見少許腺體結(jié)構(gòu)（圖3）。

2．6 基因芯片檢測結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)使用的全人類基因組芯片共包含30 968個(gè)基因探針。結(jié)果顯示：懸浮細(xì)胞球組表達(dá)上調(diào)2倍以上的基因共有358個(gè)，但是已知基因只有297個(gè)（圖4）。運(yùn)用David生物信息學(xué)系統(tǒng)分析，發(fā)現(xiàn)這297個(gè)基因大部分與代謝過程、蛋白黏附以及細(xì)胞器等有關(guān)。懸浮細(xì)胞球高表達(dá)3個(gè)干細(xì)胞相關(guān)基因，分別是ABCG2、HES1和KRT15（表3）。

圖3 NOD／SCID鼠腫瘤標(biāo)本H－E染色（SP ×400）Fig 3 H－E staining of tumor formed in NOD／SCID mice（SP ×400）

表3 懸浮細(xì)胞球組表達(dá)上調(diào)2倍以上的干細(xì)胞相關(guān)基因Tab 3 Up－regulated genes in floating spheres

2．7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果 在基因芯片檢測結(jié)果的基礎(chǔ)上，挑選出ABCG2、HES1、KRT15和CD44共4個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR相對(duì)定量法，最終得到的是樣品待測基因的相對(duì)含量（表4）。結(jié)果可見ABCG2、HES1、KRT15在懸浮細(xì)胞球中高表達(dá)，CD44表達(dá)無差異。實(shí)時(shí)熒光定量PCR與基因芯片結(jié)果基本一致。

圖4 懸浮球與貼壁細(xì)胞基因表達(dá)相關(guān)性散點(diǎn)圖Fig 4 Scatter picture of log2（fluorescence signal）of floating spheres and adherent cells

表4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測結(jié)果Tab 4 RFQ－PCR data

3 討 論

運(yùn)用特定的細(xì)胞表面標(biāo)志物和懸浮細(xì)胞球培養(yǎng)法，許多學(xué)者已經(jīng)證明了胃癌干細(xì)胞的存在［1－6］。但其來源還有待進(jìn)一步的研究證實(shí)。研究提示，胃癌干細(xì)胞可能來源于胃干細(xì)胞或是骨髓干細(xì)胞［1］。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用無血清培養(yǎng)基體外懸浮法和SP側(cè)群細(xì)胞2種方法在胃癌細(xì)胞系SGC－7901證明了具有胃癌干細(xì)胞特性的細(xì)胞，因沒有證明其全能性和多向分化能力，故稱為胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞。無血清培養(yǎng)基體外懸浮法是腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)的主要方法，應(yīng)用在神經(jīng)、乳腺等多種干細(xì)胞和相應(yīng)的腫瘤干細(xì)胞的培養(yǎng)。在胃癌干細(xì)胞的培養(yǎng)中也是常用的方法。本實(shí)驗(yàn)中，（8．00±0．54）%的SGC－7901細(xì)胞能形成懸浮細(xì)胞球，為了證明懸浮細(xì)胞球細(xì)胞是否具有腫瘤干細(xì)胞的特性，進(jìn)而檢測懸浮細(xì)胞球中SP細(xì)胞的含量。

SP細(xì)胞被認(rèn)為是具有腫瘤干細(xì)胞特性的細(xì)胞，在多種腫瘤中已經(jīng)證實(shí)SP細(xì)胞的存在。但是不同的學(xué)者對(duì)于SP細(xì)胞的干細(xì)胞特性意見不同。Zhang研究結(jié)果表明并不是所有的胃腸道腫瘤的SP細(xì)胞都富集干細(xì)胞［7］。SP法的原理依賴細(xì)胞膜表面ABC轉(zhuǎn)運(yùn)子蛋白將染料泵出細(xì)胞外，所以保持恒定的細(xì)胞生理功能至關(guān)重要。細(xì)微的實(shí)驗(yàn)條件改變會(huì)引起細(xì)胞生理功能的改變，包括孵育時(shí)間、震蕩間隔、實(shí)驗(yàn)細(xì)胞的培養(yǎng)天數(shù)和染料的濃度等均會(huì)影響SP含量，這可能是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果不一致的原因之一［8］。在嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膶?shí)驗(yàn)條件下，結(jié)果顯示懸浮細(xì)胞球SP含量遠(yuǎn)高于貼壁細(xì)胞組。

利用細(xì)胞膜表面標(biāo)記物來分離和鑒定腫瘤干細(xì)胞是一個(gè)重要的研究方法。為尋找可以作為胃癌干細(xì)胞的標(biāo)記物，本實(shí)驗(yàn)利用基因芯片技術(shù)檢測懸浮和貼壁細(xì)胞的基因表達(dá)譜，尋找差異表達(dá)基因。實(shí)驗(yàn)結(jié)果經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)懸浮細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)的基因ABCG2、HES1和KRT153。其中只有ABCG2是膜表面蛋白，屬于ABC（ATP Binding Cassette）超家族成員，是一種多藥耐藥相關(guān)的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。ABCG2／BCRP1具有將Hoechst33342泵出細(xì)胞外的特性，SP表型與ABCG2有關(guān)。She和Jiang等的研究認(rèn)為在胃癌中ABCG2與細(xì)胞分化、化療抵抗有關(guān)，具有干細(xì)胞特性［3，9］。懸浮細(xì)胞球具有干細(xì)胞的特性，而且懸浮細(xì)胞球又富含SP細(xì)胞，兩者都高表達(dá)ABCG2，因此筆者認(rèn)為ABCG2可以作為胃癌干細(xì)胞的潛在標(biāo)志之一。CD44是胃癌干細(xì)胞的標(biāo)志，但在本實(shí)驗(yàn)中表達(dá)沒有差異。采用流式細(xì)胞儀檢測懸浮細(xì)胞球和貼壁細(xì)胞CD44的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)CD44表達(dá)都＞90%。筆者認(rèn)為，這種情況與SGC－7901細(xì)胞系本身的特性相關(guān)，說明該細(xì)胞系具有高轉(zhuǎn)移潛能，并不能否定CD44作為胃癌干細(xì)胞標(biāo)志的可能性。

本研究發(fā)現(xiàn)懸浮細(xì)胞球富集SP細(xì)胞，自我更新能力強(qiáng)，具有高致瘤性且高表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志，從而證明了SGC－7901中胃癌干細(xì)胞樣細(xì)胞的存在。但是不足之處在于采用的是細(xì)胞系而非腫瘤組織。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，擬采用胃癌組織標(biāo)本進(jìn)行懸浮培養(yǎng)以及干細(xì)胞標(biāo)志物ABCG2和CD44等的檢測，希望可以為胃癌干細(xì)胞的研究提供參考依據(jù)。

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