張南文，許建華

結(jié)直腸癌屬于我國最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率呈現(xiàn)較明顯上升態(tài)勢，在大中城市中更加明顯［1］。近年來，各種新技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展使得結(jié)直腸癌的治療效果得到不斷提高［2］，但第三代鉑類配合物奧沙利鉑（oxaliplatin，L－OHP）仍是臨床上結(jié)直腸癌患者化療最常用的抗癌藥物之一。L－OHP在廣泛應(yīng)用的同時(shí)也導(dǎo)致了耐藥性出現(xiàn)的嚴(yán)重問題［3］。本實(shí)驗(yàn)以L－OHP為誘導(dǎo)劑，以遞增SW480細(xì)胞培養(yǎng)液中藥物濃度的方式，建立人結(jié)腸癌SW480／L－OHP細(xì)胞模型，通過和SW480細(xì)胞對(duì)比，對(duì)其生物學(xué)特征及產(chǎn)生耐藥的機(jī)制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 SW480人結(jié)腸癌細(xì)胞系 由福建醫(yī)科大學(xué)新藥研究所惠贈(zèng)。

1．1．2 試劑與藥品 四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT，美國Amresco公司），二甲基亞砜（DMSO，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司），新生牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），艾恒（L－OHP，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），羅丹明123（Rhodamine123，Rh123，美國Sigma公司），阿霉素（ADM，浙江海正藥業(yè)股份有限公司），順鉑（DDP，齊魯制藥有限公司），5－氟尿嘧啶（5－FU，上海旭東海普藥業(yè)有限公司）。

1．1．3 主要儀器 培養(yǎng)箱（HEPA CLASS 100，美國Thermo Forma公司），倒置顯微鏡（XDS－1B，日本Olympus公司），酶標(biāo)儀（Microplate Reader 450，美國Bio－Rad公司），臺(tái)式高速離心機(jī)（TGL－18C－C，上海安亭科學(xué)儀器廠），流式細(xì)胞儀（FACS Calibur，美國BD公司）。

1．2 方法

1．2．1 細(xì)胞培養(yǎng) 將人結(jié)直腸癌SW480細(xì)胞接種在含有10%新生小牛血清、100U／mL青霉素和100μg／mL鏈霉素的 DMEM 培養(yǎng)基中，放入37℃、體積分?jǐn)?shù)為0．05的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用含0．02%EDTA的胰酶（0．125%）消化，收集離心去上清，重懸后傳代，以臺(tái)盼藍(lán)法在細(xì)胞計(jì)數(shù)板上統(tǒng)計(jì)活細(xì)胞數(shù)量。

1．2．2 耐藥細(xì)胞系SW480／L－OHP細(xì)胞的構(gòu)建采用逐步遞增培養(yǎng)液中L－OHP濃度、間歇誘導(dǎo)的方法，從1μg／mL（1／10IC50）開始，48h后棄去含藥培養(yǎng)液，更換新鮮無藥培養(yǎng)液，等到恢復(fù)正常生長后，再次加入相同濃度藥物進(jìn)行誘導(dǎo)，如此反復(fù)，逐 步 提 高 （1μg／mL→2μg／mL→3μg／mL→4μg／mL→5μg／mL→6 μg／mL→7μg／mL→8μg／mL），間歇誘導(dǎo)。

1．2．3 測定SW480與SW480／L－OHP細(xì)胞生長曲線和群體倍增時(shí)間 將對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞消化離心后，均調(diào)整細(xì)胞數(shù)為2．5×104mL－1，分別接種于96孔板，每隔24h分別取3個(gè)復(fù)孔計(jì)算1次活細(xì)胞數(shù)量，共計(jì)算7d，以每天的活細(xì)胞數(shù)量計(jì)算群體倍增時(shí)間，公式如下：

TD＝t×log2／（logNt－logNo）

TD：群體倍增時(shí)間，t：培養(yǎng)時(shí)間，N0、Nt分別代表接種后及培養(yǎng)t小時(shí)后的細(xì)胞數(shù)。

將兩種細(xì)胞接種于96孔板（共8塊），每孔200μL（每孔5×103），各細(xì)胞設(shè)6個(gè)復(fù)孔，每天取1塊板，每孔加 MTT（5mg／mL）20μL，培養(yǎng)4h，離心并小心棄去上清，各孔加150μL DMSO，充分振蕩后，自動(dòng)酶標(biāo)儀上測各孔吸光度值（OD570）。以t為橫坐標(biāo)，以O(shè)D570值為縱坐標(biāo)，繪出生長曲線。

1．2．4 MTT法測定SW480和SW480／L－OHP細(xì)胞藥物敏感性 將對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞消化離心后，調(diào)整細(xì)胞懸液為4×104mL－1。按每孔190μL細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)24h后，加入等比稀釋成5種濃度的4種抗腫瘤藥各10μL，以及陽性對(duì)照組及陰性對(duì)照組，各濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，再培養(yǎng)48h后，MTT法測出各孔OD570。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。計(jì)算各濃度藥物的抑制率：

并算出4種抗腫瘤藥物對(duì)2種細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度（IC50）和耐藥指數(shù)（RI）：［4］

1．2．5 流 式 細(xì) 胞 儀 （FCM）檢 測 SW480 與SW480／L－OHP細(xì)胞周期分布 收集細(xì)胞后PBS洗2遍，離心并小心去掉上清液，慢慢添加－20℃預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為0．70的乙醇，固定1h。PBS洗2遍后，將等體積的細(xì)胞懸液與PI染液混合，避光4℃孵化10min，稍混勻，經(jīng)200目尼龍膜過濾到流式管中，再加入1mL的PBS，使用FCM進(jìn)行細(xì)胞周期分析。

1．2．6 細(xì)胞內(nèi)Rh123累計(jì)的測定 用含0．02%EDTA的胰酶（0．125%）消化處于對(duì)數(shù)生長期的SW480細(xì)胞和SW480／L－OHP細(xì)胞，用無血清培養(yǎng)液將細(xì)胞調(diào)整為密度1×106mL－1的單細(xì)胞懸液，分裝在EP管中，實(shí)驗(yàn)組分別加入Rh123（終濃度為2μg／mL），置于飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育50min，離心，PBS緩沖液洗2遍，再重懸于冷PBS緩沖液中。FCM檢測細(xì)胞內(nèi)平均熒光強(qiáng)度（mean fluorescence intensity，MFI），Ex 488nm，Em 530nm，觀察對(duì)細(xì)胞內(nèi)Rh123的含量。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13．0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料用±s表示，樣本均數(shù)比較采用成組t檢驗(yàn)，P＜0．05為差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 SW480／L－OHP耐藥細(xì)胞的建立及耐藥穩(wěn)定性 歷時(shí)約8月的反復(fù)誘導(dǎo)，終獲得1株能在含8μg／mL L－OHP培養(yǎng)液中良好生長的耐藥細(xì)胞系SW480／L－OHP。MTT 法 測 出 SW480 細(xì) 胞 對(duì)L－OHP的 IC50為 （11．34±3．52）μg／mL，而SW480／L－OHP細(xì)胞的IC50為（70．43±7．98）μg／mL，RI為（6．23±2．33）（P＜0．01）。在無藥培養(yǎng)液中培養(yǎng)1月后，繼用MTT法測定SW480／L－OHP細(xì)胞對(duì)L－OHP的IC50為（59．6±7．11）μg／mL，RI為（5．27±1．89），耐藥性仍保持原有的84．7%，與撤藥前比較無明顯差別（P＞0．05）。凍存3月的SW480／L－OHP細(xì)胞復(fù)蘇后生長狀態(tài)良好，其對(duì)L－OHP的IC50值為 （58．1±4．69）μg／mL，RI為（5．14±2．16），與正常培養(yǎng)的細(xì)胞比較，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0．05），耐藥性保持穩(wěn)定。

2．2 細(xì)胞生長曲線和細(xì)胞群體倍增時(shí)間 細(xì)胞生長曲線顯示（圖1），耐藥細(xì)胞株SW480／L－OHP較SW480細(xì)胞群體倍增時(shí)間稍延長，分別為（59．51±2．52）h和（33．06±1．88）h，生長增殖速度減慢，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

圖1 SW480細(xì)胞與SW480／L－OHP細(xì)胞的生長曲線Fig 1 The growth curve of SW480cells and SW480／L－OHP cells

2．3 SW480和SW480／L－OHP細(xì)胞對(duì)4種抗腫瘤藥物的敏感性 SW480和SW480／L－OHP細(xì)胞對(duì)其他3種抗腫瘤藥物5－FU、ADM及DDP的IC50見表1，SW480／L－OHP細(xì)胞對(duì)3種藥物RI值分別為（2．02±1．02），（1．93±0．88）和 （1．44±0．64）（P＜0．05）。

2．4 細(xì)胞周期分布 經(jīng)FCM進(jìn)行細(xì)胞周期分布顯示，SW480／L－OHP細(xì)胞呈現(xiàn) G2／M 期阻滯現(xiàn)象（圖2）。與SW480細(xì)胞的G2期為（11．67±1．19）%比較，SW480／L－OHP 細(xì) 胞 的 G2期細(xì) 胞 上 升 至（15．33±1．86）%，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．05）。

2．5 細(xì)胞P－gp功能 SW480細(xì)胞內(nèi)Rh123濃度（MFI）為（48．70±1．90）%，SW480／L－OHP細(xì)胞內(nèi)Rh123濃度（MFI）減少至（16．43±1．79）%，差別具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0．01，圖3）。

表1 SW480與SW480／L－OHP細(xì)胞的藥物IC50比較Tab 1 The IC50of different drugs on SW480cells and SW480／L－OHP cells

圖2 流式細(xì)胞儀觀察SW480與SW480／L－OHP細(xì)胞周期分布Fig 2 The cell cycle phase distribution of SW480cells and SW480／L－OHP cells by FCM

圖3 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)Rhodamine123蓄積量Fig 3 The intracellular accumulation of Rhodamine123assessed by FCM

3 討 論

結(jié)直腸癌化療失敗的主要因素是細(xì)胞對(duì)抗癌藥物產(chǎn)生耐藥，這也是引起腫瘤復(fù)發(fā)的主要因素之一。體外誘導(dǎo)構(gòu)建耐藥細(xì)胞株仍是研究耐藥細(xì)胞生物學(xué)變化及腫瘤耐藥機(jī)制的基礎(chǔ)［5］。國內(nèi)外專家學(xué)者已建立了多種腫瘤多藥耐藥（MDR）細(xì)胞系，構(gòu)建一株理想的MDR細(xì)胞系是研究其發(fā)生機(jī)制不可或缺的重要手段，也是探索MDR逆轉(zhuǎn)劑的必要條件［6］。

本研究以第三代鉑類——L－OHP為誘導(dǎo)劑，先從1／10IC50的濃度（1μg／mL）開始，逐漸增加培養(yǎng)液中L－OHP濃度以間歇誘導(dǎo)，成功構(gòu)建人結(jié)腸癌奧沙 利 鉑 耐 藥 細(xì) 胞 模型 SW480／L－OHP，RI為（6．23±2．33），且對(duì)5－FU、ADM、DDP等其他化學(xué)結(jié)構(gòu)和（或）作用機(jī)制不一樣的抗腫瘤藥也產(chǎn)生了一定的耐藥性。參考Snow和Judd文章［7］，RI＜5認(rèn)為是低度耐藥，RI為5～15是中度耐藥，而RI＞15歸為高度耐藥。依照此標(biāo)準(zhǔn)界定，則SW480／L－OHP細(xì) 胞 對(duì) L－OHP 是 中 度 耐 藥，對(duì)5－FU、ADM、DDP等藥物也具有低度耐藥，說明耐藥細(xì)胞系SW480／L－OHP細(xì)胞具有多藥耐藥特征。

通過繪制細(xì)胞的生長曲線，并且計(jì)算待測細(xì)胞的群體倍增時(shí)間，均可發(fā)現(xiàn)：相對(duì)于SW480細(xì)胞，SW480／L－OHP細(xì)胞的增殖生長速度有所減慢；同時(shí)，群體倍增時(shí)間明顯延長。腫瘤細(xì)胞的群體倍增時(shí)間越短，表明化療藥物對(duì)其較敏感，療效較好；反之，如果細(xì)胞群體倍增時(shí)間延長，則說明化療藥物對(duì)其敏感性下降［8］。FCM 檢測 SW480／L－OHP細(xì)胞的結(jié)果顯示，其細(xì)胞周期出現(xiàn)G2／M期阻滯現(xiàn)象，G2期細(xì)胞增多，證明其與SW480細(xì)胞相比，出現(xiàn)生長速度減慢的特征。

P－gp是目前研究較深入的ABC蛋白家族成員之一，產(chǎn)生多藥耐藥的機(jī)制之一可能是其高表達(dá)造成的，P－gp與抗癌藥物及親脂疏水性化合物相結(jié)合后，以水解ATP來供能，能逆濃度梯度將已經(jīng)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的藥物泵到細(xì)胞外去，導(dǎo)致胞內(nèi)藥物含量減少而產(chǎn)生耐藥［9］。由于羅丹明是P－gp的良好底物，且具有較好的特異性，本實(shí)驗(yàn)使用羅丹明蓄積實(shí)驗(yàn)法，檢測耐藥與親本細(xì)胞P－gp功能改變情況，樣本經(jīng)由FCM檢測分析顯示，SW480／L－OHP細(xì)胞內(nèi)羅丹明的蓄積量較SW480細(xì)胞明顯減少，表明細(xì)胞主動(dòng)外排系統(tǒng)增強(qiáng)，可能是產(chǎn)生其耐藥性的生化機(jī)制之一。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的人結(jié)腸癌耐藥細(xì)胞系SW480／L－OHP，耐藥性較穩(wěn)定且具備多藥耐藥性。在今后的研究中，課題組將繼續(xù)誘導(dǎo)并深入研究和探討腫瘤細(xì)胞對(duì)L－OHP耐藥的機(jī)制，并以此模型探索和篩選理想的逆轉(zhuǎn)耐藥的新藥。

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