衛(wèi) 冰 楊 云 劉 炯 張 杰 張華鋒

（河南中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，鄭州450046）

半邊蓮為桔梗科植物半邊蓮藥材 （Lobelia chinensis Lour.）的干燥全草。主要分布于中南、東南及西南等地［1］。具有清熱解毒、利水消腫之功效。常用于癰腫疔瘡，蛇蟲(chóng)咬傷，鼓脹水腫，濕熱黃疸，濕疹濕瘡等癥［2］?，F(xiàn)代研究表明半邊蓮全草所含化學(xué)成分主要為生物堿、多糖、黃酮苷、皂苷、氨基酸、延胡索酸等成分［3］。目前對(duì)半邊蓮藥材的研究對(duì)集中于半邊蓮生物堿的抗腫瘤活性［4］，而對(duì)于半邊蓮多糖的研究則鮮有報(bào)道，現(xiàn)有的研究業(yè)已表明植物多糖具有較好的生物活性，如免疫活性和抗腫瘤活性等，因此有必要對(duì)半邊蓮多糖進(jìn)行的系統(tǒng)的研究，用以填補(bǔ)該方面的空白。基于此本文對(duì)半邊蓮多糖的微波提取工藝進(jìn)行了研究，為其多糖的開(kāi)發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 藥材 半邊蓮藥材購(gòu)于河南鄭州張仲景大藥房，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院生藥教研室董誠(chéng)明教授鑒定為中藥半邊蓮（Lobelia chinensis Lour.）干燥全草。

1.2 儀器 島津UV－1800紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) （尤尼柯上海儀器有限公司）；MettlerAE 240十萬(wàn)分之一精密天平 （瑞士Mettler公司）；Sartorious BS224S萬(wàn)分之一精密天平 （北京賽多利斯公司）；水浴鍋 （鞏義市峪予華儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 （上海亞榮生化儀器廠）；離心機(jī) （LD25－2型）；XJA－100A型高速粉碎機(jī) （姜堰市銀河儀廠）。

1.3 試劑 無(wú)水葡萄糖 （天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心）；苯酚、硫酸等均為分析純。

1.4 多糖含量測(cè)定方法的建立

1.4.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制 精密稱(chēng)取干燥至恒重的無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品50.02mg，置100ml容量瓶中，加水溶液稀釋至刻度，搖勻，做儲(chǔ)備液備用，濃度為500.2ug／ml。

1.4.2 苯酚液的制備 稱(chēng)取苯酚100g于燒瓶中，加入NaHCO30.05g和鋁片0.1g，放置于冷凝回流裝置體系，收集182℃餾分。稱(chēng)取此餾分2.5g加水溶液中定容于50ml棕色容量瓶中即得5%苯酚溶液，避光、密封冷藏備用。

1.4.3 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇 精密吸取標(biāo)準(zhǔn)品2.0ml，置于20ml試管中，另取2.0ml蒸餾水置于20ml試管中，作為空白溶液。分別加1.0ml飽和苯酚溶液、5ml濃硫酸溶液顯色，搖勻，室溫放置40min后，于290～900nm進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，由掃描結(jié)果可知，標(biāo)準(zhǔn)品均在490nm處有最大吸收，故確定490nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

1.4.4 方法學(xué)考察

1.4.4.1 線性關(guān)系的考察 精密量取葡萄糖儲(chǔ)備液1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5ml于25ml容量瓶中，蒸餾水定容，搖勻，得葡萄糖濃度分別為20.02、30.03、40.04、50.05、60.06、70.07μg／ml 的 標(biāo) 準(zhǔn) 溶 液。按“1.4.3”項(xiàng)下操作，在490nm處測(cè)定光度，結(jié)果見(jiàn)表1。以溶液濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，得回歸方程為標(biāo)準(zhǔn)曲線方程是y＝0.0148c＋0.0403相關(guān)系數(shù)r＝0.9995。表明，葡萄糖濃度在20.02～70.07μg／ml；范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

1.4.4.2 精密度考察 取濃度為50.06μg／ml的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0ml，依照 “2.4.1”項(xiàng)下測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定5次，計(jì)算吸收度的RSD值為0.07%，表明儀器精密度良好。

1.4.4.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn) 同50.06μg／ml糖溶液6份，按“2.4.1”項(xiàng)下處測(cè)定吸光度，測(cè)定糖含量，計(jì)算吸收度的RSD為1.49%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

1.4.4.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取濃度為50.06μg／ml的的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液2.0ml，每隔20min依照 “1.4.4.1”項(xiàng)下測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定2h，其RSD值為0.54%，表明樣品在2h內(nèi)具有良好的穩(wěn)定性。

1.4.4.5 回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱(chēng)取樣品多糖 （糖含量為22.76%）6份，每份約2.8mg分別加入葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液（濃度為124.83μg／ml）5ml，定容至25ml容量瓶中，各溶液取2.0ml，依照 “1.4.4.1”項(xiàng)下測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率，得平均回收率為96.94%，RSD＝3.32%，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果 （%）

1.4.5 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 本研究采用加權(quán)評(píng)分法綜合評(píng)估［5］，半邊蓮多糖提取條件將各項(xiàng)指標(biāo)除以該列最大值再乘以100，為該項(xiàng)得分。經(jīng)處理，多糖得率和含糖量均轉(zhuǎn)化為0～100之間的數(shù)值。再根據(jù)多糖得率 （a）和含糖量 （b）作用，而確定兩者的權(quán)重系數(shù)均為0.5，對(duì)這兩項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行加權(quán)求和，通過(guò)公式M＝0.5a＋0.5b，就得到綜合評(píng)分 （M）。其中，多糖利率 （%）＝多糖質(zhì)量／藥材質(zhì)量×100%，多糖含量＝c×d／m×100%。

其中c為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程求得的濃度（μg·ml－1）；d為稀釋倍數(shù)；m為干燥后所得粗多糖的質(zhì)量（mg）。

2 結(jié)果

2.1 微波功率的選擇 稱(chēng)取6份半邊蓮藥材粗粉，每份10g，料液比1∶30，分別在80、240、400、560、720、800W不同微波功率下，提取半邊蓮多糖20min，提取2次，合并濾液，以下常規(guī)水提取工藝下操作，結(jié)果以800W為最佳提取功率。

2.2 微波提取時(shí)間的選擇 稱(chēng)取半邊蓮藥材粗粉6份，每份10g，料液比1∶30，分別在10、20、30、40、50min不同提取時(shí)間下，提取微波功率800W，提取2次，合并濾液，以下步驟水提取工藝下操作，結(jié)果以50min為最佳的提取時(shí)間。

2.3 微波提取次數(shù)的選擇 取半邊蓮藥材粗粉5份，每份30g，料液比1∶30，波提取功率為800W，每次20min，分別提取1、2、3、4、5次，合并濾液，其余步驟按常規(guī)水提取工藝操作，結(jié)果以提取三次效果最佳。

2.4 正交實(shí)驗(yàn) 選擇提取溫度、料液比、提取時(shí)間及提取次數(shù)為4個(gè)考察因素，每個(gè)因素選取3個(gè)水平，按L9（34）正交表安排實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)均平行兩份，正交因素水平見(jiàn)表2，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4。

表2 半邊蓮提取正交試驗(yàn)安排

表3 L9（34）正交試驗(yàn)表 （n，%）

表4 顯著性檢驗(yàn)

結(jié)合表3和表4，可以看出各因素影響大小順序?yàn)锳＞C＞D＞B，最佳工藝方案為A1B2C1D2，即取半邊蓮粗粉，加入30倍量水，560W微波提取30min，提取3次。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 按A1B2C1D2工藝提取，考察此工藝的穩(wěn)定性，做3組平行試驗(yàn)，結(jié)果得多糖平均得率為25.87% （RSD＝2.3%），多糖平均含量為60.13% （RSD＝3.1%），均高于正交表中的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

3 討論

3.1 粒度與浸泡時(shí)間的選擇 研究初曾考察了藥材的三種粒度：過(guò)1號(hào)篩、2號(hào)篩及1cm小段，對(duì)多糖提取率和多糖含量的影響，也考察了藥材粉末的浸泡時(shí)間對(duì)多糖提取率和含量的影響，得到過(guò)1號(hào)篩，浸泡0h的綜合評(píng)分最高。

3.2 微波提取方法的選擇 微波提取有兩種可行方式［6－7］，一種是全程均用微波提取，而另一種是以微波預(yù)處理藥液，繼以傳統(tǒng)水提取方式提取多糖。預(yù)實(shí)驗(yàn)曾以半邊蓮多糖常規(guī)水提取最佳工藝為對(duì)照，初步比較該兩種方法優(yōu)劣，發(fā)現(xiàn)全程用微波提取的評(píng)分高。

3.3 常規(guī)水提工藝 實(shí)驗(yàn)之初，曾檢閱了大量有關(guān)多糖水提的文獻(xiàn)［8－10］，確定常規(guī)的水提工藝為：加20倍水量（水體積：藥材質(zhì)量），100℃水浴回流2h，3次，合并濾液，濃縮至1∶2（藥材質(zhì)量：體積），80%醇沉過(guò)夜，依次用無(wú)水乙醇，丙酮，無(wú)水乙醚洗滌離心，揮干乙醚，即得多糖。

［1］謝若男，周建理.半邊蓮的生藥鑒定［J］.安徽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1999，18（3）：51.

［2］鄧可眾，熊英，高文遠(yuǎn).半邊蓮的化學(xué)成分研究［J］.中草藥，2009，40（8）：1198－1200.

［3］姜艷艷，石任兵，劉斌，等.半邊蓮藥效物質(zhì)基礎(chǔ)研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2009，34（3）：294－297.

［4］姜艷艷，石任兵，劉斌，等.半邊蓮中黃酮類(lèi)化學(xué)成分研究［D］.北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32（1）：59－61.

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