賈慧勤，丁煥中* ，劉曉云，李小紅，張炳旭，魯曉雄

(1．華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，廣州 510642;2．廣州萬(wàn)孚生物技術(shù)股份有限公司，廣州 510641)

呋喃唑酮是人工合成具有5－硝基呋喃基本結(jié)構(gòu)的廣譜抗菌藥物(結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖1)，代謝迅速，主要用于腸炎和菌痢的治療［1］。此藥抗菌譜廣，較少產(chǎn)生耐藥性，在養(yǎng)殖業(yè)中廣泛應(yīng)用。呋喃唑酮原藥及其主要代謝物3－氨基－2－噁唑烷酮具有致畸致突變作用［2－3］。因此含有呋喃唑酮?dú)埩舻漠a(chǎn)品被人食用后，會(huì)對(duì)人體造成嚴(yán)重危害。目前歐盟、美國(guó)、韓國(guó)、日本、韓國(guó)、中國(guó)等將呋喃唑酮列為食品動(dòng)物禁用藥物。

圖1 呋喃唑酮及其代謝物

水產(chǎn)品及畜禽產(chǎn)品中呋喃唑酮及其代謝物的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法(HPLC)［5］、高效液相色譜 －質(zhì)譜法(HPLC－MS)［6］、液相色譜 － 串聯(lián)質(zhì)譜法(LC － MS/MS)［7］、酶 聯(lián)免疫分析法(ELISA)［8］。HPLC －MS及 LC －MS/MS法的優(yōu)點(diǎn)是能夠在多種殘留物同時(shí)存在的情況下對(duì)某種特定的殘留物進(jìn)行定性、定量分析，而且靈敏度高，但受高昂的儀器成本、復(fù)雜的樣品處理過(guò)程及耗時(shí)長(zhǎng)等限制，難以在基層檢測(cè)單位普及。ELISA法操作簡(jiǎn)便快速，可大大提高檢測(cè)效率，符合現(xiàn)場(chǎng)快速篩選要求。但是目前市場(chǎng)上所有ELISA試劑盒和膠體金試紙條檢測(cè)方法都是先將生物樣品用對(duì)醛基苯甲酸衍生化，抽提出衍生物后再檢測(cè)，這種檢測(cè)方法前處理步驟繁瑣且耗時(shí)較長(zhǎng)。解決這一問(wèn)題首要是制備出抗AOZ特異性抗體，這樣樣品就不必衍生化處理，檢測(cè)時(shí)間縮短。本研究通過(guò)改造呋喃唑酮代謝物結(jié)構(gòu)得到半抗原，采用N－羥基琥珀酰亞胺活化酯法制備了人工抗原，抗AOZ特異性抗體的制備為免疫檢測(cè)方法的建立與優(yōu)化奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料及主要儀器 AOZ，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室合成;對(duì)醛基苯甲酸、鈀碳、1－乙基3－(3－二甲胺丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N－羥基琥珀酸亞胺(NHS)，阿拉丁試劑公司;牛血清白蛋白(BSA)、雞卵清白蛋白(OVA)，上海金穗生物科技有限公司;羊抗兔IgG－HRP、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑，Sigam公司;新西蘭大白兔，廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)朗儀器廠;液相色譜－串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀，安捷倫6430;紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)，UV－1800，島津公司;酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀、離心機(jī)，Thermo scientific;磁力攪拌器，鞏義市予華儀器廠。

1．2 半抗原制備與鑒定 首先以AOZ與對(duì)醛基苯甲酸反應(yīng)合成CPAOZ。取AOZ 204 mg(2 mmol)溶于5mL甲苯，磁力攪拌下加入對(duì)醛基苯甲酸300 mg(2 mmol)，100℃冷凝回流120 min。停止反應(yīng)，乙酸乙酯洗滌三次后過(guò)濾蒸干得白色固體(合成路線(xiàn)見(jiàn)圖2)。用HPLC－MS/MS鑒定目標(biāo)產(chǎn)物。

圖2 CPAOZ的合成路線(xiàn)

取234 mg(1 mmol)CPAOZ溶于4 mL N，N－二甲基甲酰胺(DMF)中，加入適量的鈀碳，通入氫氣于25℃下攪拌反應(yīng)，通過(guò)TLC板監(jiān)控反應(yīng)程度，待反應(yīng)產(chǎn)物反應(yīng)完全后用適量的乙酸乙酯進(jìn)行萃取。反應(yīng)路線(xiàn)見(jiàn)圖3。用HPLC－MS/MS鑒定目標(biāo)產(chǎn)物。

圖3 半抗原合成路線(xiàn)

1．3 完全抗原的制備 采用N－羥基琥珀酰亞胺活化酯法以BSA為載體蛋白合成人工免疫抗原。稱(chēng)取15．5 mg半抗原、18 mg EDC、11 mg NHS 溶于DMF中，反應(yīng)過(guò)夜，得A液;稱(chēng)取50 mg BSA，溶于PBS，得B液。將A液逐滴加入B液，反應(yīng)4 h。透析3 d，1 d換液2次，離心，分裝，F(xiàn)olin－酚法測(cè)定抗原濃度。紫外可見(jiàn)分光光度法鑒定完全抗原。同時(shí)，以相同偶聯(lián)方法以 OVA作為載體合成包被原。

1．4 動(dòng)物免疫 選用2只體重2 kg左右的健康雌性新西蘭大白兔，生理鹽水稀釋免疫原，經(jīng)弗氏完全佐劑乳化后皮下注射，免疫劑量為200μg/只。每隔3周進(jìn)行一次加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫時(shí)，免疫原用弗氏不完全佐劑進(jìn)行乳化。第3次免疫后的第7天耳中動(dòng)脈采血，用間接ELISA和間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法檢測(cè)抗血清效價(jià)和特異性，待血清效價(jià)和特異性穩(wěn)定后，進(jìn)行抗血清的采集。抗血清用辛酸－硫酸銨兩步法純化。

1．5 抗血清的效價(jià)及特異性測(cè)定 將包被原按預(yù)試的1μg/mL的濃度包被酶標(biāo)板，將純化好的抗血清 1 ∶10000、1 ∶20000、1 ∶40000、1 ∶80000、1 ∶160000、1 ∶320000 、1 ∶640000、1 ∶1280000 倍比稀釋?zhuān)瞄g接ELISA測(cè)定抗血清的效價(jià)，用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA測(cè)定抗血清的特異性。選擇效價(jià)高且抑制效果好的抗血清，根據(jù)方陣滴定以O(shè)D450nm值在1．0左右的稀釋度作為抗血清的工作濃度，將AOZ稀釋成濃度為 0、0．5、1．5、4．5、13．5、40．5、121．5 ng/mL的一系列標(biāo)準(zhǔn)品溶液，建立間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

將AOZ結(jié)構(gòu)類(lèi)似物呋喃它酮代謝物、呋喃妥因代謝物、呋喃西林代謝物，按AOZ標(biāo)準(zhǔn)品相同的方法稀釋成一系列標(biāo)準(zhǔn)濃度，進(jìn)行間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA檢測(cè)，得出其半抑制濃度(IC50)值，計(jì)算它們與AOZ的交叉反應(yīng)率。交叉反應(yīng)率=(AOZ IC50/結(jié)構(gòu)類(lèi)似物IC50)×100%。

2 結(jié)果

2．1 半抗原結(jié)構(gòu)鑒定 半抗原的分子量為234，分子離子峰為235(圖4)，表明目標(biāo)化合物合成成功，且純度大于85%，能達(dá)到偶聯(lián)要求。

圖4 半抗原質(zhì)譜圖

2．2 完全抗原鑒定 由紫外分光光度計(jì)鑒定完全抗原。由圖5可見(jiàn)，半抗原在272 nm處、BSA在278 nm處有最大吸收，而完全抗原紫外掃描圖不同于半抗原和BSA，完全抗原偶聯(lián)了一定數(shù)量的半抗原，在最大吸收波長(zhǎng)發(fā)生明顯偏移，從而初步判定偶聯(lián)成功。

圖5 完全抗原紫外掃描

2．3 抗血清的檢測(cè) 第4次免疫后，檢測(cè)出有AOZ特異性抗體產(chǎn)生，抗體效價(jià)為1280000，結(jié)果見(jiàn)表1。以O(shè)D值在1．0左右的稀釋度作為抗體工作濃度，將243 ng/mL的AOZ標(biāo)準(zhǔn)液稀釋建立間接競(jìng)爭(zhēng) ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(圖6)，線(xiàn)性方程為:y=－12．2 Ln(x)+98．88，R2=0．994，x 表示待測(cè)物濃度，y表示抑制率，計(jì)算得 IC50為 5．9 ng/mL，在1～27 ng/mL呈線(xiàn)性關(guān)系，以相同方法對(duì)抗血清的交叉反應(yīng)性進(jìn)行測(cè)定，對(duì)結(jié)構(gòu)類(lèi)似物AMOZ、AHD、SEM的交叉反應(yīng)率分別為 0．76%、0．02%、0．02%、0．83%。

表1 AOZ抗血清的效價(jià)

圖6 AOZ間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

3 討論

AOZ屬小分子半抗原，不具有免疫原性，需與載體蛋白偶聯(lián)以合成人工完全抗原，因而制備出有效的完全抗原是制備AOZ特異性抗體的關(guān)鍵。目前制備呋喃唑酮代謝物抗原的常用方法是將AOZ的氨基和對(duì)羧基苯甲醛的醛基縮合反應(yīng)合成半抗原CPAOZ，偶聯(lián)蛋白后制備完全抗原，此種方法制備的抗CPAOZ單克隆抗體IC50可達(dá)0．30 ng/mL，但是對(duì) AOZ卻沒(méi)有特異性［9－10］，這樣在檢測(cè)過(guò)程中就要將待檢物AOZ衍生化為CPAOZ，此過(guò)程操作繁瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，不能滿(mǎn)足現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)的要求。本方案也引入了對(duì)羧基苯甲醛，但是還原了C=N雙鍵，以減小共軛結(jié)構(gòu)對(duì)抗原活性的影響，保證抗AOZ特異性抗體的產(chǎn)生，而非是CPAOZ特異性抗體。也曾嘗試過(guò)在AOZ的氨基上引入4－溴丁酸乙酯或者丁二酸酐作為間隔臂，但是可能由于改造過(guò)的半抗原分子量過(guò)小，分子的空間結(jié)構(gòu)過(guò)于簡(jiǎn)單，未能得到高效價(jià)和高特異性的抗體。

本研究成功制備了半抗原，與BSA偶聯(lián)后，經(jīng)紫外掃描對(duì)抗原的偶聯(lián)情況進(jìn)行鑒定，半抗原與載體的偶聯(lián)比為16∶1。一般認(rèn)為偶聯(lián)比在5∶1～30∶1范圍內(nèi)能產(chǎn)生較好的特異性抗體［11－12］。本實(shí)驗(yàn)得到的偶聯(lián)比為16，通過(guò)免疫新西蘭大白兔得到了較高靈敏度的抗血清，與結(jié)構(gòu)非常相近的呋喃它酮代謝物幾乎沒(méi)有交叉反應(yīng)，其IC50為5．9 ng/mL，雖然與目前已報(bào)道的檢測(cè)方法的靈敏度有較大差距，但這是對(duì)硝基呋喃代謝物的快速檢測(cè)方案優(yōu)化的新嘗試。此方案對(duì)抗原合成和抗體制備還需進(jìn)一步的研究和探索。

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