丁緒芹，張勁松，王福嶺

(1．明治醫(yī)藥(山東)有限公司，山東濟(jì)寧 272100;2．山東勝利生物工程有限公司，山東濟(jì)寧 272100)

多粘菌素E是一種堿性多肽類抗生素，獸用硫酸粘菌素商品為其硫酸鹽。目前生產(chǎn)中主要通過樹脂法分離提?。?－2］，但此法帶來大量的污水，嚴(yán)重污染環(huán)境。文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)于多粘菌素E分離技術(shù)較多，如膜分離法、溶媒萃取法、吸附法［3］、泡沫分離法［4］，但都處于試驗(yàn)階段，尚未形成成熟工藝，無法應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)。沉淀法分離抗生素是一種傳統(tǒng)方法，操作簡單，但由于多粘菌素在較強(qiáng)酸堿溶液中的不穩(wěn)定性，目前尚無利用此法的生產(chǎn)報(bào)道。本文通過對(duì)沉淀法分離多粘菌素E進(jìn)行研究，優(yōu)化各項(xiàng)工藝操作參數(shù)，以期得到一種適用于工業(yè)化生產(chǎn)的分離工藝。

1 材料與方法

1．1 材料與儀器 多粘菌素E標(biāo)品由上海江萊生物科技有限公司提供，硫酸及硫酸鹽(AR)由濟(jì)南市恒德銳化工有限公司生產(chǎn)。

高壓液相色譜(LC－3000，山東金普分析儀器有限公司)，陶瓷膜超濾設(shè)備(合肥世杰膜工程有限責(zé)任公司)，恒溫水浴鍋(DHKW，北京中興偉業(yè)儀器有限公司)，真空泵(SHZ－C全不銹鋼，上?；ゼ褍x器設(shè)備有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 發(fā)酵液預(yù)處理 2%硫酸調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH 4．8左右，酸化0．5 ～1 h 后，陶瓷膜超濾。

1．2．2 多粘菌素E測(cè)定 采用高效液相色譜法(HPLC)，參照文獻(xiàn)［5－6］提供方法。

1．2．3 結(jié)晶及濃縮液制備方法 取一定體積超濾液，濃堿緩慢均勻攪拌加入，pH調(diào)至12．3～12．5，靜置0．5 h后過濾抽干即得濕晶體，濕晶體用1 mol/L酸溶解后，去離子水定容至1/10體積。

1．2．4 計(jì)算方法 總億=效價(jià)×體積/109;收率(%)=濃縮液總億/超濾液總億×100%;母液殘留率(%)=母液殘留總億/超濾液總億×100%;降解率(%)=100%–(收率+母液殘留率)。

2 結(jié)果與分析

2．1 溫度對(duì)多粘菌素E穩(wěn)定性及結(jié)晶收率影響

在不同的水浴溫度中靜置結(jié)晶(圖1)，20℃左右收率達(dá)到最高，此時(shí)母液殘留率及降解率達(dá)到最低點(diǎn)。結(jié)果表明:過低溫度不利于多粘菌素結(jié)晶，可能與其沉淀是非晶體絮凝物有關(guān)，相對(duì)較高的溫度有利于絮凝沉淀快速形成，從而減少母液中游離肽的降解量。

圖1 結(jié)晶溫度對(duì)多粘菌素E沉淀效果的影響

不同溫度條件下，延長母液及濕晶體在堿性條件下的處理時(shí)間，分別測(cè)定溫度對(duì)母液中游離肽和沉淀結(jié)晶的影響。

不同溫度條件下母液處理結(jié)果如圖2所示，堿性條件下溫度對(duì)游離肽的穩(wěn)定性影響較大，6 h時(shí)5℃降解率3%左右，15℃降解率升至13%以上，25℃以上時(shí)降解率達(dá)到40%。結(jié)果表明:較高溫度條件下游離肽的穩(wěn)定性差，同時(shí)降解率隨處理時(shí)間的延長明顯升高。

圖2 堿性條件下溫度對(duì)游離肽降解率的影響

溫度對(duì)濕晶體穩(wěn)定性的影響如圖3所示，低溫條件下濕晶體的穩(wěn)定性相對(duì)較高，同時(shí)隨著時(shí)間延長，降解率的累積明顯升高，6 h時(shí)5℃條件下，降解率接近2%。

圖3 堿性條件下溫度對(duì)濕晶體穩(wěn)定性的影響

結(jié)果表明:堿性條件下，游離肽的穩(wěn)定性較差，易發(fā)生降解或與低糖及氨基酸產(chǎn)生美拉德反應(yīng)［7－8］，而沉淀狀態(tài)結(jié)晶穩(wěn)定性高。低溫不利于沉淀結(jié)晶快速形成，導(dǎo)致降解量升高，而過高的溫度直接加速降解反應(yīng)速率，也不利于結(jié)晶收率。因此，最佳的結(jié)晶溫度在20℃左右，既有利于結(jié)晶快速大量形成，同時(shí)降解率相對(duì)偏低，有利于得到最高的結(jié)晶收率。

2．2 pH對(duì)多粘菌素E穩(wěn)定性及結(jié)晶收率影響試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，在pH接近9．0時(shí)，開始出現(xiàn)大量絮狀沉淀結(jié)晶，因此考察了晶體出現(xiàn)前的pH對(duì)多粘菌素E最終收率的影響(圖4)。pH調(diào)至試驗(yàn)設(shè)定值時(shí)靜置0．5 h 后，調(diào)至12．3 ～12．5 結(jié)晶。

圖4 結(jié)晶過程中間pH對(duì)結(jié)果的影響

結(jié)果可見，pH＞8．5時(shí)，游離態(tài)多粘菌素的穩(wěn)定性開始快速下降，容易發(fā)生降解反應(yīng);同時(shí)說明游離肽在堿性條件下的存在時(shí)間對(duì)收率有重要影響，即較短的結(jié)晶時(shí)間，沉淀加速析出，降低了游離肽的降解時(shí)間及降解量。

結(jié)晶pH對(duì)結(jié)晶效果的影響如圖5所示，結(jié)果可見:pH在11．5～12．0之間，結(jié)晶收率為88%左右，達(dá)到最高。pH過低，母液中殘留效價(jià)較高，導(dǎo)致降解率較高;反之pH過高，直接導(dǎo)致降解速率加快，收率降低。結(jié)果表明:pH 11．5～12．0時(shí)，收率較高，且降解率相對(duì)較低。

圖5 結(jié)晶pH對(duì)多粘菌素E結(jié)晶效果的影響

圖6 結(jié)晶靜置時(shí)間對(duì)結(jié)晶效果的影響

2．3 結(jié)晶時(shí)間對(duì)多粘菌素E穩(wěn)定性及結(jié)晶收率影響 多粘菌素E在堿性條件下穩(wěn)定性較差，結(jié)晶時(shí)間對(duì)其降解量及收率影響可能較大。結(jié)晶后靜置時(shí)間對(duì)結(jié)晶效果的影響(圖6):0．5h時(shí)母液殘留最高，降解率最低;1 h左右收率達(dá)到最高，之后收率下降，母液殘留率基本穩(wěn)定在4% ～4．5%，降解率快速升高。結(jié)果表明:結(jié)晶后靜置1 h左右有利于完全沉淀，時(shí)間過長，則降解率過高，不利于收率提高。

進(jìn)一步考察結(jié)晶過程pH調(diào)節(jié)速率對(duì)結(jié)晶效果的影響(圖7):結(jié)果可見，隨著加堿時(shí)間延長，收率逐步降低，降解率升高，與上步試驗(yàn)相印證。結(jié)果表明:縮短pH調(diào)節(jié)時(shí)間快速結(jié)晶，有利于結(jié)晶快速出現(xiàn)，減少降解時(shí)間，提高收率。

圖7 pH調(diào)節(jié)速率對(duì)結(jié)晶效果的影響

2．4 晶種對(duì)多粘菌素E穩(wěn)定性及結(jié)晶收率影響

pH調(diào)至9．5左右時(shí)，結(jié)晶開始明顯出現(xiàn)，此時(shí)加入不同量晶種(圖8)。

圖8 外加晶種量對(duì)結(jié)晶效果的影響

結(jié)果可見，添加1‰量晶種，收率達(dá)到90%，加晶種組收率明顯高于對(duì)照組，同時(shí)降解率及母液殘留率也較低，說明加入晶種增加晶核量，對(duì)沉淀結(jié)晶的出現(xiàn)及生長有促進(jìn)作用。

0．5‰晶種加入時(shí)pH對(duì)結(jié)晶效果的影響(圖9):pH 9．5時(shí)加入晶種，收率接近90%，明顯高于其他組。pH 9．8時(shí)，自然晶核已經(jīng)大量形成，外加晶核作用減弱，晶核量加入過少，差異性不顯著;pH 9．2時(shí)，晶核加入過早對(duì)收率影響不大。

圖9 0．5‰晶種加入pH對(duì)結(jié)晶效果的影響

結(jié)果表明:pH 9．5時(shí)，外加0．5‰ ～1‰晶種對(duì)結(jié)晶有明顯促進(jìn)作用。

2．5 保護(hù)劑對(duì)多粘菌素E穩(wěn)定性及結(jié)晶收率影響

試驗(yàn)初期發(fā)現(xiàn)還原性保護(hù)劑對(duì)多粘菌素E在高溫條件下的穩(wěn)定性有一定幫助作用，結(jié)晶過程保護(hù)劑對(duì)結(jié)晶效果的影響如圖10所示。

圖10 不同保護(hù)劑比例對(duì)結(jié)晶效果的影響

結(jié)果可見，母液中殘留效價(jià)隨助劑的加入量增多而提高，降解率升高，導(dǎo)致收率降低。結(jié)果表明:保護(hù)劑對(duì)多粘菌素E可能有一定鹽溶影響，增加其游離態(tài)溶解度，導(dǎo)致不易沉淀，降解率升高，總體上保護(hù)劑對(duì)收率未發(fā)揮積極作用。

2．6 過濾溫度對(duì)多粘菌素E穩(wěn)定性及結(jié)晶收率影響 過濾時(shí)間在2～3 h，且結(jié)晶液和晶體處于堿性條件，試驗(yàn)中環(huán)境及設(shè)備溫度對(duì)多粘菌素的穩(wěn)定性都可能造成影響，過濾溫度對(duì)母液及晶體的穩(wěn)定性如圖11所示。

結(jié)果可見:5℃時(shí)收率最高達(dá)到96%以上，母液殘留幾乎為0，降解率小于3%，溫度升高各項(xiàng)指標(biāo)都對(duì)收率不利。結(jié)果表明:結(jié)晶液在過濾前降低溫度至10℃以下，有利于穩(wěn)定性以及收率提高。

圖11 過濾溫度對(duì)結(jié)晶效果的影響

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，最佳結(jié)晶條件:pH 11．5～12．0，結(jié)晶溫度 15 ～20 ℃，結(jié)晶后靜置 0．5 ～1 h，最高收率達(dá)到95%以上，脫色后噴霧干燥，成品各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到CP和EP標(biāo)準(zhǔn)。目前尚未解決的問題主要有濃縮液色素量不穩(wěn)定對(duì)結(jié)晶及脫色過程的影響、脫色及成品質(zhì)量穩(wěn)定性等，有待進(jìn)一步研究和探索。

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