戴志紅，蔣 卉，李 翠，張秀英，溫 芳，陸連壽，孫海燕，魏 津，關(guān)孚時(shí)，王在時(shí)

(中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，北京 100081)

豬瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由豬瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起的一種高度接觸性、致死性的豬傳染病，在世界上很多國家(地區(qū))［1－2］包括我國［3－4］均有發(fā)生，給畜牧業(yè)生產(chǎn)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將豬瘟列為法定通報(bào)性疫?。?］，我國將其劃為一類動(dòng)物傳染?。?］，并納入重大動(dòng)物疫病防控計(jì)劃。豬瘟病毒抗體檢測是豬瘟診斷、免疫效果評(píng)價(jià)和流行病學(xué)調(diào)查的重要手段，但其敏感度和準(zhǔn)確性易受方法、人員、試劑、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物等諸多因素影響。豬瘟病毒陰、陽性血清國家參考品則是控制和校準(zhǔn)豬瘟抗體檢測的實(shí)物“標(biāo)尺”，但我國目前尚缺乏豬瘟病毒陰、陽性血清國家參考品。為了研制該參照品，本研究對(duì)制備的1批豬瘟病毒陽性血清進(jìn)行了熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)，以考察凍干工藝與產(chǎn)品的貯存有效期是否符合預(yù)期。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 豬瘟病毒陽性血清 豬瘟病毒陽性血清，經(jīng)過濾分裝至1 mL長頸安瓿(每支分裝1 mL)，凍干、抽真空后熔封，計(jì)1000支，由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所制備(批號(hào)200905－3)。

1．1．2 試劑 豬瘟抗體 ELISA檢測試劑盒(Lot No．43220－T761)，Idexx公司。

1．2 方法

1．2．1 試驗(yàn)方案 采用經(jīng)典恒溫?zé)峒铀俜€(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，從幾個(gè)較高溫度下樣品的效價(jià)失活情況計(jì)算其在較低溫度下的貯存有效期。隨機(jī)抽取40支血清樣品，分別在 25、37、45、56 ℃下保溫，分別于 0、1、2、3、4、8、12、24 周隨機(jī)抽取1 支樣品，按照 1 ∶400、1∶450～1∶800系列稀釋，每個(gè)稀釋度重復(fù)3孔，用豬瘟抗體ELISA檢測試劑盒檢測其效價(jià)(最大陽性稀釋倍數(shù))(注:盡量在同條件下、在同一酶標(biāo)儀上檢測)。

1．2．2 不同溫度下的失活速率常數(shù)k的計(jì)算 大部分蛋白質(zhì)或生物制品的活性失活基本上都符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)［7－8］。一級(jí)反應(yīng)的速率方程(公式1)為:ln c=ln c0－kt，式中的 c為效力值(或其他活性單位值)，c0為初始效力值，k為失活速率常數(shù)，t為時(shí)間。將不同溫度下的加速穩(wěn)定性數(shù)據(jù)按公式1擬合線性回歸方程，據(jù)此求出不同溫度下的k值。

1．2．3 －20℃下失活速率常數(shù)k的計(jì)算 不同溫度的失活速率常數(shù)k與溫度的動(dòng)力學(xué)關(guān)系符合Arrhenius方程［9］(公式 2):ln k= － Ea/RT+ln A，T為絕對(duì)溫度，R為摩爾常數(shù)，Ea為活化能，A為指前因子。將25、37、45、56℃下失活速率常數(shù) k按公式2擬合出線性回歸方程，據(jù)此求出－20℃下的k值。

1．2．4 －20℃下貯存有效期的計(jì)算 根據(jù)－20℃下的失活速率常數(shù)k及公式1，即可計(jì)算出樣品效價(jià)由初始效價(jià)降低到目標(biāo)效價(jià)所需的時(shí)間，即為該樣品的貯存有效期。

1．2．5 持續(xù)穩(wěn)定性監(jiān)測 隨機(jī)抽?。?0℃下保存1年后的制品5支，按1．2．1項(xiàng)方法測定其效價(jià)，以后每隔一定時(shí)間監(jiān)測一次。

2 結(jié)果

2．1 不同溫度下的熱加速試驗(yàn)結(jié)果 血清在25、37、45、56℃時(shí)的熱加速試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期相符，保存溫度越高，效價(jià)下降速度越快(表1)。

表1 不同溫度下的熱加速試驗(yàn)結(jié)果

2．2 不同溫度下的失活速率常數(shù)k 將不同溫度下的熱加速穩(wěn)定性數(shù)據(jù)按公式1擬合出線性回歸方程(圖1)，結(jié)果R2值均大于0．95，相關(guān)性良好，得出了不同溫度下的k值。

2．3 －20℃下失活速率常數(shù)k 將25、37、45、56℃下失活速率常數(shù)k按公式2擬合出線性回歸方程(圖2)，據(jù)此求出 －20 ℃下的k值為5．874 ×10－5。

2．4 －20℃下的貯存有效期 根據(jù)－20℃下的失活速率常數(shù)k及公式1，計(jì)算出樣品效價(jià)由初始效價(jià)1∶800降低到95%(即1∶760)所需的時(shí)間為16．8 年。

2．5 持續(xù)穩(wěn)定性監(jiān)測 結(jié)果顯示，5支樣品的ELISA效價(jià)均為1∶800，制品活性未發(fā)生明顯下降，與熱加速穩(wěn)定試驗(yàn)預(yù)期一致。

圖1 不同溫度下效價(jià)隨時(shí)間變化擬合線性回歸

圖2 不同溫度下k值擬合線性回歸

3 討論

通常在較低的保存溫度下(2～8℃或－20℃)生物制品的失活速度很慢，加之生物制品活性出現(xiàn)的細(xì)微下降不易被非常準(zhǔn)確地測定，因此在較低溫度下，研究者往往很難在短時(shí)間內(nèi)(幾周以至幾個(gè)月)根據(jù)生物制品的失活數(shù)據(jù)和公式1得到比較準(zhǔn)確的k值，從而計(jì)算制品在該溫度下的貯存有效期。而生物制品在較高溫度下的失活速度很快，利用Arrhenius方程和幾個(gè)溫度下的加速失活數(shù)據(jù)，則可以從較高溫度下的k值估算較低溫度下的k值，再根據(jù)k值和公式1預(yù)測制品在低溫保存條件下的穩(wěn)定性。因此，熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)可以在較短時(shí)間內(nèi)比較準(zhǔn)確地預(yù)測制品在某溫度下的貯存有效期。

3．1 熱加速溫度點(diǎn)的選擇 根據(jù)Arrhenius方程擬合線性回歸必須至少要有3個(gè)溫度點(diǎn)的k值，因此熱加速穩(wěn)定試驗(yàn)選擇的溫度點(diǎn)要在3個(gè)以上。此外，要根據(jù)制品在幾個(gè)溫度點(diǎn)下的失活數(shù)據(jù)和公式1擬合線性回歸得到比較準(zhǔn)確的k值，則需要科學(xué)選擇試驗(yàn)的溫度點(diǎn)，要求溫度點(diǎn)之間有較大間隔并且制品在這些溫度點(diǎn)下失活速度較快而又不能過快，以保證擬合線性回歸的相關(guān)系數(shù)較好(一般要求R2≥0．95)。若溫度點(diǎn)間隔較小，則k值隨溫度變化不明顯，會(huì)導(dǎo)致擬合線性回歸不理想;若溫度太高以致失活太快，則該溫度下失活的有效數(shù)據(jù)太少，也會(huì)導(dǎo)致擬合線性回歸不理想。如擬合線性回歸失敗或不理想，可以適當(dāng)調(diào)整試驗(yàn)溫度。本試驗(yàn)選擇25、37、45、56℃為溫度點(diǎn)，結(jié)果擬合線性回歸的R2均大于0．95，說明溫度點(diǎn)的選擇是合適的。

3．2 測定方法的選擇 熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)所選擇的測定方法需要有足夠的靈敏度、精密度和重復(fù)性。此外，還需保證每個(gè)溫度下的測定次數(shù)(至少3次)，因此測定時(shí)需選擇適當(dāng)?shù)臅r(shí)間間隔，可先在熱加速初期密集測定，再根據(jù)下降趨勢調(diào)整測定頻率。本試驗(yàn)選擇ELISA檢測方法，并且由同一操作者在同一實(shí)驗(yàn)室用同一儀器盡量按照相同條件完成測量，保證了較佳的測定條件，并且試驗(yàn)成本較低。在每個(gè)溫度下測定次數(shù)的選擇上，本試驗(yàn)采取了先密后疏的策略，在熱加速初期每周測定1次，后來逐漸加大了測定之間的時(shí)間間隔，這樣既能檢測到效價(jià)的細(xì)微下降，又能檢測到大的下降趨勢，也保證了總的測定次數(shù)。結(jié)果顯示，擬合線性回歸的相關(guān)系數(shù)較好，說明測定方法的選擇和測定時(shí)間間隔的安排也是合理的。

3．3 持續(xù)穩(wěn)定性監(jiān)測 由于生物制品本身的復(fù)雜性，加之溫度點(diǎn)的選擇、每個(gè)溫度點(diǎn)的測定次數(shù)和每次測定的樣品數(shù)量有限，用熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)預(yù)測制品的貯存有效期也必然存在一定局限性，仍不能完全替代持續(xù)穩(wěn)定性研究，預(yù)測值和實(shí)際值之間的偏差也有很大的不確定性。因此，用熱加速穩(wěn)定性試驗(yàn)預(yù)測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的貯存有效期，可以用于可能影響標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)穩(wěn)定性的工藝和環(huán)節(jié)的篩選和研究，也可以方便估算標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在多個(gè)溫度下的有效期供參考，在標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)實(shí)際提供使用后，仍需定期或不定期進(jìn)行持續(xù)穩(wěn)定性監(jiān)測，以確實(shí)保證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的有效性。

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