劉廷江 谷守義 王剛

缺氧是惡性腫瘤的一種常見現(xiàn)象，可導(dǎo)致一系列基因的表達(dá)發(fā)生變化。低氧誘導(dǎo)因子-1α(Hypoixa inducible factor-1α，HIF-1α)在其中發(fā)揮著重要調(diào)控作用［1，2］。有研究表明，HIF-1α在膀胱癌、食管癌、胃癌等多種惡性腫瘤中表達(dá)增高［3-5］，但迄今有關(guān)HIF-1α在膀胱癌細(xì)胞中的作用機(jī)制還沒有完全闡明。有研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α可以通過影響Survivin、Bcl-2等凋亡抑制基因而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的抗凋亡作用［6，7］，但有關(guān)膀胱癌中HIF-1α與腫瘤細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究尚不多見。因此，本研究檢測了HIF-1α、Survivin、Bcl-2在不同膀胱移行細(xì)胞癌組織及正常膀胱組織中的表達(dá)，對(duì)HIF-1α在膀胱癌中的作用和臨床意義進(jìn)行了初步探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 臨床標(biāo)本取自2009年12月至2012年4月在我科治療并有病理證實(shí)的68例膀胱移行細(xì)胞癌患者，其中男51例，女17例;年齡39～78歲，平均年齡(61±11)歲?；颊吲R床病歷資料中，腫瘤病理分級(jí)：G1 24例、G2 28例、G3 16例;腫瘤分期：Ta～1 28例、T2～4 40例;初發(fā)膀胱癌42例，復(fù)發(fā)26例。另取20例正常膀胱組織(均取自良性前列腺增生行開腹前列腺切除患者)作為對(duì)照。

1.2 方法 免疫組織化學(xué)染色(SP法)檢測HIF-1α、Survivin、Bcl-2蛋白表達(dá)。兔抗人HIF-1α、Survivin、Bcl-2多克隆抗體、免疫組化試劑盒均購自美國Santa Cruz公司，按試劑盒說明采用SP法分別對(duì)腫瘤組織和正常膀胱組織對(duì)HIF-1α、Survivin、Bcl-2蛋白進(jìn)行免疫組化染色，用PBS代替一抗做陰性對(duì)照、已知陽性切片作陽性對(duì)照。由兩位病理醫(yī)師雙盲閱片進(jìn)行結(jié)果判定。每張切片均隨機(jī)取400倍光鏡視野5個(gè)，在每視野中計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞。HIF-1α、Survivin、Bcl-2均以細(xì)胞漿呈黃色認(rèn)為陽性染色。按腫瘤細(xì)胞陽性率和細(xì)胞著色強(qiáng)度分別記分。按陽性率記分標(biāo)準(zhǔn)：無陽性細(xì)胞為0分，陽性細(xì)胞≤10%為1分，11% ～50%為2分，51% ～80%為3分，＞80%為4分。按著色強(qiáng)度記分標(biāo)準(zhǔn)：無著色為0分，淡黃色為1分，黃色為2分，棕黃色為3分。兩種記分相乘結(jié)果為0～1為陰性(-)，2～3為弱陽性(+)，4～7陽性(++)，≥8強(qiáng)陽性(+++)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件，免疫組化結(jié)果以等級(jí)資料表示，HIF-1α、Survivin、Bcl-2在腫瘤和正常膀胱組織中的比較、腫瘤病理分期之間的比較、初發(fā)癌與復(fù)發(fā)癌之間的比較采用秩相關(guān)檢驗(yàn);HIF-1α、Survivin、Bcl-2在不同腫瘤病理分級(jí)之間的關(guān)系應(yīng)用χ2檢驗(yàn);各蛋白質(zhì)之間的關(guān)系分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌和正常膀胱組織中HIF-1α、Survivin、Bcl-2蛋白表達(dá)強(qiáng)度 68例膀胱癌組織中HIF-1α、Survivin、Bcl-2蛋白陽性表達(dá)率分別為 63.24%(43/68)、73.53%(50/68)、48.53%(33/68);正常膀胱組織3種蛋白表達(dá)陽性率分別為5.00%(1/20)、35.00%(7/20)、15.00%(3/20)。經(jīng)比較，HIF-1α、Survivin、Bcl-2在腫瘤組織中的表達(dá)均較正常膀胱組織增強(qiáng)(均P ＜0.05)。見表1、圖1～3。

表1 膀胱癌和正常膀胱組織HIF-1α、Survivin、Bcl-2的表達(dá)情況例

圖1 HIF-1α在膀胱癌組織的陽性表達(dá)(SP×200)

圖3 Bcl-2在膀胱癌組織的陽性表達(dá)(SP×200)

2.2 膀胱癌組織HIF-1α、Survivin、Bcl-2蛋白表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)、分期的關(guān)系 膀胱癌組織中HIF-1α在不同分級(jí)、分期的腫瘤中表達(dá)陽性率分別為：G1 45.83%(11/24)、G2 67.86%(19/28)、G3 81.25%(13/16);Ta～1期陽性率為50.00%(14/28)、T2～4期為72.50%(29/40)。Survivin在不同分級(jí)、分期的腫瘤中表達(dá)陽性率分別為：G1 54.17%(13/24)、G2 82.14%(23/28)、G3 87.50%(14/16);Ta-1期陽性率為64.29%(18/28)、T2～4期為80.00%(32/40)。Bcl-2在不同分級(jí)、分期的腫瘤中表達(dá)陽性率分別為：G1 37.50%(9/24)、G2 53.57%(15/28)、G3 56.25%(9/16);Ta～1期陽性率為35.71%(10/28)、T2～4期為57.50%(23/40)。HIF-1α、Survivin、Bcl-2蛋白表達(dá)強(qiáng)度均隨腫瘤病理分級(jí)、分期進(jìn)展而增強(qiáng)(均P＜0.05)。見表2。

表2 膀胱癌組織HIF-1α、Survivin、Bcl-2表達(dá)與腫瘤病理分級(jí)、分期的關(guān)系 例

2.3 初發(fā)膀胱癌組織與復(fù)發(fā)癌組織中HIF-1α、Survivin、Bcl-2的表達(dá)強(qiáng)度 初發(fā)膀胱癌組織中HIF-1α、Survivin表達(dá)強(qiáng)度均低于復(fù)發(fā)癌組織(均P＜0.05)，而Bcl-2在初發(fā)膀胱癌組織與復(fù)發(fā)癌組織中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表3 初發(fā)和復(fù)發(fā)膀胱癌HIF-1α、Survivin、Bcl-2的表達(dá)情況 例

2.4 膀胱癌和正常膀胱組織中HIF-1α、Survivin、Bcl-2蛋白表達(dá)的關(guān)系 Spearman等級(jí)相關(guān)分析顯示：膀胱癌組織中3種蛋白之間，HIF-1α與Survivin、HIF-1α與Bcl-2間表達(dá)均具有正相關(guān)性(r=0.4486，0.3428，P=0.0001，0.0042)，Survivin 與Bcl-2之間表達(dá)無相關(guān)性(r=0.2016，P=0.0992)。

3 討論

膀胱移行細(xì)胞癌是泌尿系統(tǒng)常見惡性腫瘤。雖然近年來有關(guān)該病的治療取得了很大進(jìn)展，但膀胱癌仍存在易復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。且復(fù)發(fā)的膀胱癌往往病理分級(jí)更高、分期更晚、惡性程度更高，導(dǎo)致進(jìn)一步轉(zhuǎn)移，甚至危及患者生命［8］。而關(guān)于膀胱癌發(fā)生進(jìn)展的機(jī)制目前尚未完全明確。尋找與膀胱癌發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切的基因?qū)Υ_定腫瘤標(biāo)志物、了解預(yù)后因素、確定生物治療靶標(biāo)有重要意義。HIF-1α是近期發(fā)現(xiàn)與膀胱癌關(guān)系密切的基因之一。惡性腫瘤在生長過程中快速增長，導(dǎo)致腫瘤局部缺氧，研究表明腫瘤體積一旦大于1 mm3，腫瘤就會(huì)處于缺氧狀態(tài)，腫瘤細(xì)胞將高表達(dá)HIF-1α，促進(jìn)下游多種基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄，使腫瘤細(xì)胞適應(yīng)缺氧的微環(huán)境。在前列腺癌、肺癌、腎癌、肝癌等多種惡性腫瘤中均檢測到了高度表達(dá)的HIF-1α，而在正常組織中 HIF-1α無表達(dá)或弱表達(dá)［1-5］。本研究顯示，HIF-1α在膀胱癌組織中表達(dá)與正常膀胱組織比較明顯增強(qiáng)，且HIF-1α隨病理分級(jí)、腫瘤分期進(jìn)展而表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。結(jié)果與其他報(bào)道［9，10］類似。說明 HIF-1α與膀胱癌發(fā)生密切相關(guān)，且隨腫瘤惡性程度增高而表達(dá)增強(qiáng)，提示HIF-1α可能作為膀胱癌腫瘤標(biāo)志物及復(fù)發(fā)預(yù)測因子。

惡性腫瘤細(xì)胞多具有較強(qiáng)的凋亡抵抗能力，這種能力使腫瘤細(xì)胞生存能力更強(qiáng)，是導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展的重要原因［11］。腫瘤凋亡抵抗形成過程中多種基因發(fā)揮了作用，Survivin、Bcl-2就是近年來受到關(guān)注的凋亡抵抗基因。Survivin是目前發(fā)現(xiàn)的IAP家族中最小的成員，可通過調(diào)控caspases表達(dá)直接抑制細(xì)胞凋亡［12］;Bcl-2則通過線粒體途徑影響下游基因而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡［13］。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Survivin、Bcl-2在膀胱癌組織中表達(dá)高于正常膀胱組織;Survivin隨病理分級(jí)、腫瘤分期進(jìn)展而表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng);病理分級(jí)高的膀胱癌組織的Bcl-2表達(dá)更強(qiáng)。這些結(jié)果與其他研究報(bào)道結(jié)果一致［14］。提示Survivin、Bcl-2可能通過調(diào)控腫瘤細(xì)胞的凋亡而參與了膀胱癌的進(jìn)展。但本研究也顯示，Bcl-2表達(dá)在初發(fā)癌和復(fù)發(fā)癌組織中差異并不明顯，與其他報(bào)道有所不同［15］。我們認(rèn)為這可能是由于我們的樣本量較小造成的，但具體原因還有待于進(jìn)一步研究。

已有研究證實(shí)，缺氧狀態(tài)可導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞的凋亡抵抗能力增強(qiáng)，HIF-1α的過表達(dá)可導(dǎo)致Survivin、Bcl-2等基因的表達(dá)增高［6，7］，但這種調(diào)控關(guān)系是否存在于膀胱癌中報(bào)道尚不多見。因此本研究進(jìn)一步分析了膀胱癌組織中HIF-1α與Survivin、Bcl-2蛋白表達(dá)的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HIF-1α與 Survivin、HIF-1α與Bcl-2蛋白之間均存在正相關(guān)關(guān)系，提示膀胱癌中HIF-1α可能通過調(diào)控Survivin、Bcl-2表達(dá)而抑制腫瘤細(xì)胞凋亡，從而導(dǎo)致腫瘤的進(jìn)展。但具體機(jī)制和途徑尚需體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)予以證實(shí)。

本研究初步證實(shí)了HIF-1α、Survivin、Bcl-2在膀胱癌組織中均存在表達(dá)增強(qiáng)，HIF-1α可能通過影響Survivin、Bcl-2表達(dá)而促進(jìn)膀胱癌進(jìn)展。但我們的研究還處于初級(jí)階段，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量并進(jìn)行基礎(chǔ)研究明確膀胱癌中HIF-1α、Survivin、Bcl-2之間的具體關(guān)系并開展針對(duì)膀胱癌HIF-1α基因的靶向治療對(duì)膀胱癌治療進(jìn)展具有重要意義。

1 Thomas S，Harding MA，Smith SC，etal.CD24 Is an Effector of HIF-1-Driven Primary Tumor Growth and Metastasis.Cancer Res，2012，72：5600-5612.

2 Liu XQ，Xiong MH，etal.Therapeutic Delivery of siRNA Silencing HIF-1 Alpha with Micellar Nanoparticles Inhibits Hypoxic Tumor Growth.Mol Pharm，2012，9：2863-2874.

3 周錦堂，蔡志明，李寧忱，等.缺氧誘導(dǎo)因子lα和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)因子1蛋白在腎癌和膀胱癌組織表達(dá)的臨床意義.中華醫(yī)學(xué)雜志，2006，86：1970-1974.

4 Takala H，Saarnio J，Wiik H，etal.HIF-1α and VEGF are associated with disease progression in esophageal carcinoma.J Surg Res，2011，167：41-48.

5 Zheng Y，Shi X，Wang M，etal.Theincreased expression of DEC1 gene is related to HIF-1α protein in gastric cancer cell lines.Mol Biol Rep，2012，39：4229-4236.

6 Li G，Xie B，Li X，etal.Down-regulation of survivin and hypoxia-inducible factor-1αbyβ-elemene enhances the radiosensitivity of lung adenocarcinoma xenograft..Cancer Biother Radiopharm，2012，27：56-64.

7 Klymenko T，Brandenburg M，Morrow C，etal.The novel Bcl-2 inhibitor ABT-737 is more effective in hypoxia and is able to reverse hypoxia-induced drug resistance in neuroblastoma cells.Mol Cancer Ther，2011，10：2373-2383.

8 Librenjak D，Novakovi ZS，Milosti K.Carcinoma in situ of urinary bladder：incidence，treatment and clinical outcomes during ten-year followup.Acta Clin Croat，2012，51：201-207.

9 鄧建華，白進(jìn)良，馬鵬程，等.谷胱甘肽轉(zhuǎn)硫酶-Pi與缺氧誘導(dǎo)因子-1α在膀胱癌組織中的表達(dá)及其意義.癌癥，2006，25：190-193.

10 彭曉暉，祖雄兵.缺氧誘導(dǎo)因子-1α和血管內(nèi)皮生長因子在膀胱癌中的表達(dá)及其與微血管密度的關(guān)系.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2009，19：2787-2789，2792.

11 Wong JC，Bathina M，F(xiàn)iscus RR.Cyclic GMP/protein kinase G type-Iα(PKG-Iα)signaling pathway promotes CREB phosphorylation and maintains higher c-IAP1，livin，survivin，and Mcl-1 expression and the inhibition of PKG-Iαkinase activity synergizes with cisplatin in non-small cell lung cancer cells.JCell Biochem，2012，113：3587-3598.

12 McKenzie JA，Grossman D.Role of the apoptotic and mitotic regulator survivin in melanoma.Anticancer Res，2012，32：397-404.

13 Weyhenmeyer B，Murphy AC，Prehn JH，etal.Targeting the anti-apoptotic bcl-2 family members for the treatment of cancer.Exp Oncol，2012，34：192-199.

14 程瑞祥，馬志強(qiáng)，楊書文，等.Survivin在膀胱癌中的研究進(jìn)展.中國全科醫(yī)學(xué)，2008，11：182-184.

15 陳兵海，楊建軍，姚茂銀.P-gp、MRP、Bcl-2、Bax在膀胱癌中的表達(dá)及其意義.東南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2007，26：279-282.