顧向飛, 邊平江, 周小龍, 林志華, 董迎輝

(1. 寧波大學(xué) 海洋學(xué)院, 浙江 寧波 315211; 2. 浙江萬里學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源有效利用技術(shù)研究重點實驗室, 浙江 寧波 315100; 3. 浙江省海洋水產(chǎn)養(yǎng)殖研究所, 浙江 溫州 325005)

櫛江珧(Atrina pectinata), 又名江珧蛤、牛角江珧蛤、牛角蚶等, 隸屬于軟體動物門(Mollusca)瓣鰓綱(Lamellibranchia)貽貝目(Mytiloida)江珧科(Pinnidae)江珧?qū)?Atrina)[1]。櫛江珧廣泛分布于溫、熱帶泥砂質(zhì)的近海區(qū)域, 屬于廣溫、廣鹽性的海產(chǎn)經(jīng)濟貝類, 主要分布于我國的福建、廣東等沿海省份,在北方的山東、遼寧等海區(qū)也有分布[2]。櫛江珧具有較高的食用價值, 是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ暮ＫB(yǎng)殖種類。

近年來, 關(guān)于櫛江珧人工繁育和繁殖生物學(xué)方面的研究已見諸報道, 如開展了親貝人工促熟、稚貝附著基的選擇[3-4]以及雌核發(fā)育單倍體誘導(dǎo)[5]等人工繁育研究, 進行了生殖細(xì)胞發(fā)生的研究[6-7]、受精過程的細(xì)胞學(xué)觀察[8]、精子超低溫冷凍保存以及精子線粒體熒光活性檢查[9-10]等繁殖生物學(xué)研究。但是, 尚未見到關(guān)于櫛江珧精子超微結(jié)構(gòu)的研究報道。本研究利用透射電鏡技術(shù)對櫛江珧精子的超微結(jié)構(gòu)進行了觀察, 旨在為物種鑒定、生殖進化及受精機理研究提供細(xì)胞學(xué)依據(jù)。

1 材料方法

1.1 實驗材料

櫛江珧于2012年4月取自廣東湛江東海島自然海區(qū), 貝齡2～3 a, 殼長20～25 cm, 于寧波甬盛水產(chǎn)種業(yè)有限公司暫養(yǎng)。暫養(yǎng)期間混合喂養(yǎng)微綠球藻(Nannochloropsis oculata)、亞心形扁藻(Platymonas subcordiformis)、牟氏角毛藻(Chaetoceros miielleri),以促進性腺發(fā)育。

1.2 精巢取樣及透射電鏡觀察

櫛江珧暫養(yǎng)2周后, 隨機抽取雄性個體, 活體解剖取精巢, 切成小塊, 用4℃ 2.5%戊二醛和1%鋨酸雙固定, 4℃冷藏保存。固定樣品經(jīng)0.1 mol/dm3磷酸緩沖液漂洗, 30%～90%梯度乙醇脫水, 90%丙酮置換,無水丙酮脫水, Epon 812環(huán)氧樹脂包埋, 在日立H-7650透射電鏡下對精巢樣品切片進行觀察并拍照。

2 櫛江珧精子超微結(jié)構(gòu)電鏡觀察結(jié)果

櫛江珧精子形態(tài)為近圓形, 屬于鞭毛型。成熟的精子由頭部、中段和尾部3部分構(gòu)成。頭部長度約3 μm, 包括頂體(acrosome)和細(xì)胞核(nucleus)(圖1a)。中段則由中心粒復(fù)合體(centriolar complex)和線粒體(mitochondria)構(gòu)成。尾部為鞭毛型。

圖1 櫛江珧精子的超微結(jié)構(gòu)Fig. 1 Ultrastructure of spermatozoon in Atrina pectinata

2.1 頂體

頂體位于精子頭部最前端, 在透射電鏡下可觀察到頂體明顯突出。頂體縱切面呈倒“V”形, 在精子縱切面中軸方向上, 頂體長度約 0.7 μm, 占精子頭部長度的 1/5。頂體物質(zhì)外包被一層膜, 根據(jù)其位置可分為頂體內(nèi)膜(inner acrosomal membrane)和頂體外膜(outer acrosomal membrane), 二者圍成頂體腔(acrosomal space)(圖1b), 腔內(nèi)頂體物質(zhì)分布不均勻,靠近頂體外膜的為電子密度較大的弧狀帶。頂體外膜與質(zhì)膜之間存在一薄層胞質(zhì), 頂體內(nèi)膜與細(xì)胞核形成亞頂體腔(subacrosomal space)(圖1b、圖1c), 腔內(nèi)亞頂體物質(zhì)電子密度均勻且較低。

2.2 細(xì)胞核

頂體后部緊接著細(xì)胞核, 細(xì)胞核呈近球形, 直徑約 2.0 μm, 長度約 1.7 μm, 占精子頭部體積的大部分(圖1d)。細(xì)胞核是一個電子致密區(qū)域, 內(nèi)含有高度濃縮的染色質(zhì), 同時可觀察到不規(guī)則染色較淺的核泡(nuclear vacuole)存在(圖1a)。細(xì)胞核前端略凹陷, 形成核前窩; 無核后窩; 在后端與線粒體相鄰處, 細(xì)胞核向內(nèi)凹陷形成植入窩(implantation fossa)(圖1e、圖1f), 線粒體嵌于植入窩內(nèi)。

2.3 中段

中段位于頭部和鞭毛之間, 由中央的中心粒復(fù)合體和呈輻射狀排列的線粒體構(gòu)成。中心粒復(fù)合體由近端中心粒(proximal centriole)和遠(yuǎn)端中心粒(distal centriole)構(gòu)成(圖1e), 兩個中心粒均為圓柱狀,由9組微管組成。遠(yuǎn)端中心粒是鞭毛的基體, 在末端發(fā)出鞭毛, 其長軸與精子的長軸方向一致, 近端中心粒則與遠(yuǎn)端中心?；ハ啻怪薄Ｖ卸螜M切面可以觀察到5個線粒體(圖1f)。線粒體嵌入細(xì)胞核的植入窩,為近橢圓形或球形, 長軸約0.3 μm, 短軸約0.2 μm。線粒體電子密度均勻且較低, 由內(nèi)外兩層膜組成,內(nèi)膜向腔內(nèi)折疊形成線粒體嵴。

2.4 尾部

精子的尾部為鞭毛型, 橫切面呈圓形, 直徑約0.25 μm, 內(nèi)部為軸絲(axoneme), 外部包被的質(zhì)膜(plasma membrane)呈波浪狀(圖1g、圖1h)。軸絲由遠(yuǎn)端中心粒末端發(fā)出, 起始端無中央微管, 為外周的9組二聯(lián)微管結(jié)構(gòu), 起始端之后為典型的“9+2”型結(jié)構(gòu)。

3 討論

頂體是位于細(xì)胞核與質(zhì)膜之間的囊狀細(xì)胞器,是一種特化的溶酶體, 含有多種水解酶類, 如透明質(zhì)酸酶、酸性磷酸酶、蛋白水解酶等, 能夠溶解卵細(xì)胞的外被及濾泡細(xì)胞, 產(chǎn)生孔道, 使精子進入卵細(xì)胞[11]。 頂體酶作為受精過程中的關(guān)鍵酶, 在精子穿透卵膜時起溶解卵膜的作用, 對于營體外受精的貝類是十分重要的, 因而頂體酶活性高低可直接影響受精[12]。而對于褶紋冠蚌(Cristaria plicata)[13]、三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)[14]等受精過程發(fā)生在雌貝外鰓腔內(nèi)的淡水蚌類而言, 受精環(huán)境相對穩(wěn)定的, 并且卵的膠質(zhì)卵膜較薄, 精子無需發(fā)達(dá)的頂體就可入卵, 因此這些貝類精子頂體通常體積較小, 結(jié)構(gòu)簡單[15]。頂體腔內(nèi)電子密度反映腔內(nèi)的物質(zhì)組成, 簾文蛤(Meretrix lyrata)[15]、西施舌(Coelomactra antiquata)[16]、溝紋巴非蛤(Paphia exarata)[17]等基部靠近核的位置電子密度較高; 而櫛江珧與文蛤(Meretrixmeretrix)[18]、 彩虹明 櫻 蛤(Moerella iridescens)[19]、翡翠貽貝(Perna viridis)[20]、合浦珠母貝(Pinctada martensi)[21]等類似, 靠近頂體外膜內(nèi)側(cè)的位置電子密度較高, 推測腔內(nèi)電子密度反映腔內(nèi)頂體酶的分布。櫛江珧精子頂體結(jié)構(gòu)為明顯的倒“V”字形, 且頂體約占整個頭部的 1/3, 頂體腔及亞頂體腔內(nèi)含有電子密度不同的酶, 這與其生存的海水環(huán)境及體外受精機制是相適應(yīng)的。

貝類精子結(jié)構(gòu)在不同種屬間存在差異, 對于貝類系統(tǒng)分類具有重要意義[22]。多數(shù)雙殼貝類精子的細(xì)胞核為卵圓形, 如溝紋巴非蛤[23]、墨西哥灣扇貝(Argopecten irradians concentricus)[24]; 少數(shù)貝類精子的細(xì)胞核為圓柱形, 如櫛孔扇貝(Chlamys farreri)[25]、蝦夷扇貝(Patinopecten yessoensis)[26]等: 還有一些貝類精子的細(xì)胞核近圓錐形, 如菲律賓蛤仔(Ruditapes philippinarum)[27]、斧文蛤(Meretrix lamarkii)[28]等; 但也存在特殊形態(tài)的細(xì)胞核, 如彩虹明櫻蛤的細(xì)胞核為螺旋狀[19]。櫛江珧精子的細(xì)胞核為近球形, 生物細(xì)胞的結(jié)構(gòu)形狀與功能是相統(tǒng)一的,精子細(xì)胞核的形狀在一定程度上適應(yīng)其在水中的運動以及穿透卵膜的能力, 從而提高受精的成功率。

核前窩是頂體絲突起的重要結(jié)構(gòu)基礎(chǔ), 而核后窩是精子尾部鞭毛形成的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ); 核前窩的存在使得精子可以容納更多的亞頂體腔物質(zhì), 增加受精成功率[29]。精子細(xì)胞核的核前窩的有無在科內(nèi)較為接近但存在差異, 如蚶科的毛蚶(Scapharca subcrenata)[29]、泥蚶(Tegillarca granosa)[30]及魁蚶(Scapharca broughtonii)[31]的精子細(xì)胞核形狀接近, 均為有核后窩而無核前窩, 但同科的青蚶(Barbatia virescens)[23]的細(xì)胞核則具有核前窩及核后窩。核前窩、核后窩的有無并不能作為判別物種間親緣關(guān)系的依據(jù), 仍需引入其他可度量指標(biāo)[15]。櫛江珧精子具有核前窩, 使得其精子具有較大的亞頂體腔, 以容納一些亞頂體腔物質(zhì), 雖不具有核后窩, 但具有完整的中心粒復(fù)合體, 具有完整的尾部結(jié)構(gòu), 有助于其在海水中游動及穿透卵膜完成受精。

線粒體切面通常呈卵圓形, 是由內(nèi)外兩層彼此平行的單位膜套疊而形成的封閉的囊狀結(jié)構(gòu), 內(nèi)膜向內(nèi)折疊形成嵴, 嵴上分布有大量的呼吸鏈酶系及ATP 酶復(fù)合體, 可為精子運動和入卵過程提供能量[11]。同種雙殼貝類精子線粒體數(shù)目通常一致, 不同種類精子線粒體數(shù)目會有細(xì)微不同。通過比較雙殼貝類精子超微結(jié)構(gòu), 發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)精子線粒體數(shù)目為 4～5 個, 偶見 6 個[18]; 而本研究通過觀察精子中段橫截面, 發(fā)現(xiàn)櫛江珧具有5個線粒體, 沒有發(fā)現(xiàn)4個或者6個的情況, 故可以推斷櫛江珧精子線粒體數(shù)目較為穩(wěn)定。根據(jù)細(xì)胞代謝的需要, 線粒體在細(xì)胞質(zhì)中可以進行運動、融合或者分裂增殖[11]。根據(jù)精子發(fā)生過程的研究可知, 線粒體的數(shù)目及位置在精細(xì)胞的早期就基本確定, 但在精子發(fā)生過程中存在著小個體線粒體融合成為個體較大線粒體的現(xiàn)象,據(jù)此雙殼貝類中成熟精子線粒體數(shù)目不一致是因為線粒體融合出現(xiàn)偏差。

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