王曉艷，馮麗娟，蔣鳳華，鄭 立，趙美麗，許振華

（1.國家海洋局第一海洋研究所海洋生態(tài)研究中心，山東 青島266061；2.中國海洋大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島266100；3.青島科技大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院，山東 青島266042）

隨著海洋石油鉆探開發(fā)及運(yùn)輸業(yè)等的發(fā)展，石油已經(jīng)成為海洋常見的污染物之一。石油中所含的芳香烴及其衍生物，可使海洋生物中毒，高濃度污染甚至?xí)鸷Ｑ笊锏乃劳觯瑢Ｑ笊鷳B(tài)系統(tǒng)造成極大的破壞［1］。因此，進(jìn)行石油的海洋生態(tài)毒理學(xué)研究，對于石油的污染效應(yīng)評價(jià)和海洋溢油生態(tài)損害評估具有重要意義。

石油等污染物進(jìn)入水生生物體后，可通過自身或中間代謝產(chǎn)物的氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生大量活性氧自由基，如H2O2和O－2·。這些自由基如不被及時(shí)清除，會引起氧化應(yīng)激，進(jìn)而產(chǎn)生酶失活、DNA斷裂和脂質(zhì)過氧化等毒性效應(yīng)。貝類體內(nèi)的抗氧化防御系統(tǒng)如超氧化物歧化酶（Superoxide Dismutase，SOD）和過氧化氫酶（Catalase，CAT）等在清除活性氧自由基、防止氧代謝物的損傷等方面具有重要作用，是機(jī)體的重要抗氧化酶［2］。丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物中的一類，它可使DNA、膜蛋白和酶等發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)，增加膜的通透性，導(dǎo)致細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)、功能和代謝發(fā)生改變，對機(jī)體造成損傷甚至死亡。因此，測定MDA的含量可反映生物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化（Lipid peroxidation，LPO）的程度，從而間接反映細(xì)胞受損傷的程度［3］。

近年來，國內(nèi)外開展了一些污染物對魚類和雙殼類等水生生物抗氧化酶系統(tǒng)和MDA含量影響的研究［4－11］，但原油水溶性成分（Water soluble fraction of crude oil，WSF）對櫛孔扇貝抗氧化酶活性和 MDA含量影響的研究仍未見報(bào)道。

雙殼貝類為濾食性底棲動物，分布范圍廣，生活方式固定，對其生活環(huán)境中的石油烴污染物有較強(qiáng)的生物蓄積作用。貽貝監(jiān)測計(jì)劃就是通過測定貝類體內(nèi)污染物的殘留量，對其周圍海洋環(huán)境的污染程度和變化趨勢進(jìn)行監(jiān)測和評價(jià)。作者以我國近岸海域重要經(jīng)濟(jì)貝類－櫛孔扇貝為實(shí)驗(yàn)對象，初步研究了 WSF對扇貝血淋巴細(xì)胞DNA損傷［12］，而本文則研究不同濃度WSF對櫛孔扇貝鰓和消化盲囊中SOD、CAT活性和MDA含量的影響。研究結(jié)果以期為石油污染對貝類影響的毒理學(xué)研究提供基礎(chǔ)參數(shù)，并為溢油損害評估提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用櫛孔扇貝（Chlamys farreri）購自青島流清河養(yǎng)殖區(qū)，洗凈后清除其體表附著物，用清潔海水暫養(yǎng)1周，每日投喂金藻1次，清除死貝，待其狀態(tài)穩(wěn)定后，選取活力好，體長4～5cm的個(gè)體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 儀器和試劑

主要儀器：立式超低溫保存箱（青島海爾DW－86L626），熒光分光光度計(jì)（日本 Hitachi FL－4500），超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司KQ－400KDE），分光光度計(jì)（尤尼柯（上海）儀器有限公司 WFJ2000），恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠 HH·S21－8S），分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司BS224S），低溫高速離心機(jī)（德國Hermle公司Z383K）。

主要試劑：考馬斯亮藍(lán)G－250為美國Sanland公司分析純產(chǎn)品，其余試劑為國產(chǎn)分析純試劑。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 含WSF海水的制備及其濃度測量 實(shí)驗(yàn)用原油取自天津中海油平臺，原油與海水按1∶10（V／V）混合，超聲分散1h，靜置4h后吸取水相即為母液，置于棕色玻璃瓶中4℃保存?zhèn)溆谩Ｄ敢褐惺蜔N含量按照海洋監(jiān)測規(guī)范方法［13］進(jìn)行測量。

1.3.2 暴露實(shí)驗(yàn)和樣品處理 依據(jù)國家海水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)，一、二類石油烴含量≤0.05mg·L－1，三類石油烴含量≤0.30mg·L－1，四類石油烴含量≤0.50mg·L－1［14］，結(jié)合青島膠州灣海水和嶗山近岸海水中石油烴的濃度分布［15－16］，選用體積為50cm×40cm×35cm的玻璃水槽，分別加入不同體積含WSF的海水，實(shí)驗(yàn)溶液總體積為30L，測量各組實(shí)際濃度分別為0.02、0.18、0.32和0.51mg·L－1。將櫛孔扇貝隨機(jī)分為4組，每組40只，充氣泵24h充氣，每日投喂100mL金藻（密度為1×106～2×106個(gè)·mL－1）1次，更換1／3體積相同濃度的實(shí)驗(yàn)溶液，以使WSF濃度保持相對穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)期間水溫保持18～20℃。

在暴露實(shí)驗(yàn)的第1、2、4、7和10天采樣，10d后將實(shí)驗(yàn)溶液全部換為清潔海水進(jìn)行為期4d的恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。每次隨機(jī)選取3只扇貝，仔細(xì)分離出鰓和消化盲囊，預(yù)冷（4℃）超純水沖洗后用濾紙吸干水分，稱重，裝在鋁箔折成的小袋中，－80℃保存。

將鰓和消化盲囊置于預(yù)冷（4℃）的磷酸鹽緩沖液中（NaCl0.014mol·L－1，KCl0.003mol·L－1，Na2HPO4·12H2O0.01mol·L－1，KH2PO40.002mol·L－1，pH＝7.4），冰浴下勻漿（1∶9，w／v），然后立即離心（4℃，10 000×g·min－1，30min），取上清液用于酶活性測定。

1.3.3 毒理學(xué)指標(biāo)的測定 使用SOD試劑盒、CAT試劑盒和MDA試劑盒，按照說明書進(jìn)行操作。

SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定，其定義為：每毫克組織蛋白在1mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50%時(shí)所對應(yīng)的SOD量為一個(gè)活力單位。

CAT活性采用鉬酸銨顯色法測定，其定義為：每毫克組織蛋白每秒鐘分解1μmol的H2O2的量為一個(gè)活力單位。

MDA采用硫代巴比妥酸（TBA）比色法測定。蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)方法進(jìn)行測定。

1.4 數(shù)據(jù)的處理和分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 11.5軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，用one way－ANOVA進(jìn)行差異性顯著分析，與對照組相比，0.01＜P＜0.05認(rèn)為差異顯著，P＜0.01認(rèn)為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 不同暴露時(shí)間下WSF對櫛孔扇貝鰓和消化盲囊SOD活性的影響

如圖1（a）所示，實(shí)驗(yàn)期間對照組鰓中SOD活性的變化范圍為59.60～77.39U／mg。0.18mg·L－1濃度組SOD活性隨暴露時(shí)間延長而逐漸增加，前2天時(shí)SOD活性低于對照組，表明受到抑制；第4天后一直高于對照組，表明SOD活性被誘導(dǎo)。0.32mg·L－1濃度組SOD活性在實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)無顯著變化，一直被抑制。0.51mg·L－1濃度組SOD活性在第1天時(shí)被極顯著誘導(dǎo)，高出對照組39.04%；之后隨著時(shí)間的延長SOD活性逐漸降低，且一直被極顯著抑制。進(jìn)一步分析表明，第2天時(shí)SOD活性與 WSF濃度存在很好的負(fù)相關(guān)性（n＝12，r＝0.991，P＜0.01），即隨 WSF濃度增加SOD活性降低。4d恢復(fù)實(shí)驗(yàn)后，0.18mg·L－1濃度組SOD活性被顯著誘導(dǎo)，而0.32和0.51mg·L－1濃度組SOD活性則極顯著低于對照組，抑制率分別為36.11%和53.45%。

由圖1（b）可見，對照組消化盲囊中SOD活性的變化范圍為25.57～38.86U／mg，顯著低于對照組鰓的SOD活性（P＜0.01）。0.18mg·L－1濃度組SOD活性在第4和10天時(shí)與對照組相比無顯著差異，其余時(shí)間均被顯著誘導(dǎo)。0.32和0.51mg·L－1濃度組SOD活性表現(xiàn)出大致相同的變化趨勢，均呈現(xiàn)峰值變化，第1天時(shí)與對照組相比無顯著差異；隨暴露時(shí)間延長SOD活性逐漸增加，分別在第7和4天達(dá)最大值，并一直被極顯著誘導(dǎo)。進(jìn)一步分析表明，第2～10天內(nèi)SOD活性與WSF濃度均存在很好的正相關(guān)性（n＝12，r＝0.947～0.985，P＝0.015～0.053）。4d恢復(fù)實(shí)驗(yàn)后，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的SOD活性均處于被誘導(dǎo)狀態(tài)（P＜0.01）。

2.2 不同暴露時(shí)間下 WSF對櫛孔扇貝鰓和消化盲囊CAT活性的影響

圖1 不同濃度WSF作用下櫛孔扇貝的SOD活性變化Fig.1 Effects of WSF of crude oil on SOD activities of Chlamys farreri

如圖2（a）所示，對照組鰓中CAT活性的變化范圍為19.75～37.76U／mg。0.18mg·L－1濃度組CAT活性隨暴露時(shí)間沒有產(chǎn)生顯著變化，實(shí)驗(yàn)期間一直被極顯著誘導(dǎo)。除第7天外，0.32mg·L－1濃度組CAT活性在其余時(shí)間內(nèi)一直被誘導(dǎo)。0.51mg·L－1濃度組CAT活性呈現(xiàn)峰值變化，第4天達(dá)到最大值，實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)一直被誘導(dǎo)（P＜0.01或0.01＜P＜0.05）。4d恢復(fù)實(shí)驗(yàn)后，0.18mg·L－1濃度組CAT活性被顯著誘導(dǎo)，0.32mg·L－1濃度組CAT活性恢復(fù)到對照組水平，而0.51mg·L－1濃度組CAT活性則極顯著低于對照組，抑制率為63.67%。

由圖2（b）可見，對照組消化盲囊中CAT活性的變化范圍為8.07～12.77U／mg，顯著低于對照組鰓的CAT活性（P＜0.01）。3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的CAT活性表現(xiàn)出大致相同的變化趨勢，第1天時(shí)CAT活性均被極顯著誘導(dǎo)，且酶活性與WSF濃度存在很好的正相關(guān)性（n＝12，r＝0.980，0.01＜P＜0.05）；隨暴露時(shí)間延長CAT活性逐漸降低，分別在第10、7和4天時(shí)開始被抑制，且第10天時(shí)酶活性與WSF濃度存在負(fù)相關(guān)性（n＝12，r＝0.941，P＝0.059）。4d恢復(fù)實(shí)驗(yàn)后，0.18mg·L－1濃度組CAT活性被誘導(dǎo)，0.32mg·L－1濃度組CAT活性被抑制，但與對照組相比均無顯著差異；0.51mg·L－1濃度組CAT活性極顯著低于對照組，抑制率為47.20%。

圖2 不同濃度WSF作用下櫛孔扇貝的CAT活性變化Fig.2 Effects of WSF of crude oil on CAT activities of Chlamys farreri

2.3 不同暴露時(shí)間下 WSF對櫛孔扇貝鰓和消化盲囊MDA含量的影響

如圖3（a）所示，對照組鰓中 MDA含量在11.86～15.56nmol／mg范圍內(nèi)。第1天時(shí)，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組MDA含量均低于對照組，且含量值與WSF濃度存在很好的負(fù)相關(guān)性（n＝12，r＝0.963，0.01＜P＜0.05）。第2天后0.18mg·L－1濃度組MDA含量一直高于對照組，且持續(xù)增加，表明損傷程度也逐漸增加。0.32mg·L－1濃度組MDA含量在第2天時(shí)顯著低于對照組，第4天開始趨于穩(wěn)定，并一直高于對照組。0.51mg·L－1濃度組MDA含量自第2天開始一直高于對照組，并于第4天達(dá)到最大值，高出對照組78.48% （P＜0.01）。進(jìn)一步分析表明，第4天時(shí)MDA含量與WSF濃度存在很好的正相關(guān)性（n＝12，r＝0.998，P＜0.01）。4d恢復(fù)實(shí)驗(yàn)后，0.18mg·L－1濃度組 MDA含量恢復(fù)到對照組水平，而0.32和0.51mg·L－1濃度組 MDA含量分別高出對照組23.54% （0.01＜P＜0.05）和45.86%（P＜0.01）。

圖3 不同濃度WSF作用下櫛孔扇貝的MDA含量變化Fig.3 Effects of WSF of crude oil on MDA contents of Chlamys farreri

由圖3（b）可見，對照組消化盲囊中MDA含量的變化范圍為205.19～236.86nmol／mg，極顯著高于鰓（P＜0.01），表明消化盲囊受氧化脅迫程度較鰓嚴(yán)重。0.18mg·L－1濃度組MDA含量除在第2和4天時(shí)與對照組相比無顯著差異之外，其余時(shí)間內(nèi)均極顯著低于對照組。0.32mg·L－1濃度組MDA含量在實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)無顯著變化并一直高于對照組，且第1和10天時(shí)與對照組存在極顯著差異。0.51mg·L－1濃度組MDA含量在第4天時(shí)顯著低于對照組，其余時(shí)間極顯著高于對照組。4d恢復(fù)實(shí)驗(yàn)后，0.18mg·L－1濃度組MDA含量恢復(fù)到對照組水平，而0.32和0.51mg·L－1濃度組MDA含量分別高出對照組14.82% （P＜0.01）和20.63% （P ＜0.01）。

3 討論

SOD、CAT和MDA是研究生物對各種污染脅迫效應(yīng)中受到密切關(guān)注的生理指標(biāo)?？寡趸福⊿OD、CAT）的作用是清除活性氧自由基，從而保護(hù)生物體；此外，酶活性的變化還可以間接反映出生物體內(nèi)自由基含量的變化［17］。脂質(zhì)過氧化是細(xì)胞受損傷的機(jī)制之一，MDA作為脂質(zhì)過氧化指標(biāo)，其含量的增加意味著細(xì)胞器和細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能的破壞，進(jìn)而可能導(dǎo)致組織器官的病變，發(fā)生疾?。?8］。

研究發(fā)現(xiàn)，對照組消化盲囊中SOD、CAT活性均低于鰓，這與文獻(xiàn)［8－9，19－20］中的報(bào)道不一致。其原因可能是鰓作為雙殼類生物的呼吸器官和濾食器官與外界水體環(huán)境接觸最廣泛。由于消化盲囊中SOD和CAT活性低于鰓，因而導(dǎo)致前者M(jìn)DA含量高于后者，這與部分文獻(xiàn)報(bào)道一致［18，20－22］。張培玉等［20］認(rèn)為抗氧化酶越敏感的器官，受損傷的程度則越嚴(yán)重，即抗氧化酶下降越大，膜脂質(zhì)過氧化程度越嚴(yán)重。

對鰓和消化盲囊中SOD、CAT活性和MDA含量進(jìn)行相關(guān)性分析，得出如下結(jié)果：鰓組織中SOD、CAT和MDA之間不存在顯著相關(guān)性；對消化盲囊而言，第4和10天的MDA和CAT之間分別呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性（r＝0.8561，n＝12，P＝0.014）和負(fù)相關(guān)性（r＝－0.8289，n＝12，P＝0.021），第14 天的 SOD 和MDA呈現(xiàn)顯著的正相關(guān)性（r＝0.7663，n＝12，P＝0.045）。實(shí)驗(yàn)期間，SOD和CAT并未表現(xiàn)出同步性。王重剛等［23］、楊曉斌等［24］和賴廷和等［17］的研究中也有類似的現(xiàn)象產(chǎn)生，究其原因可能在于O－2·的歧化反應(yīng)不是H2O2的唯一來源，后者也可通過氨基酸或細(xì)胞色素P450氧化酶的激活而獲得［25］。

低濃度WSF暴露初期，鰓和消化盲囊中SOD和CAT活性均表現(xiàn)出代償性增強(qiáng)，清除體內(nèi)產(chǎn)生的過量活性氧自由基，從而保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷，表現(xiàn)為MDA含量低于對照組。但隨著WSF濃度和暴露時(shí)間的增加，自由基不斷積累，細(xì)胞受氧化損傷的程度不斷加重，SOD和CAT清除能力逐漸趨于飽和，活性也逐漸降低。因而，0.51mg·L－1濃度組扇貝鰓和消化盲囊中 MDA含量均顯著增加，這與Pan等［26］和王凡等［27］的研究結(jié)果相一致。研究表明石油的毒性作用機(jī)制主要是石油代謝中產(chǎn)生的自由基對免疫細(xì)胞如吞噬細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化作用，影響了雙殼類的免疫功能［19］。

此外，實(shí)驗(yàn)過程中還可觀察到0.32和0.51mg·L－1濃度處理下消化盲囊SOD活性一直被誘導(dǎo)，這可能是由于消化盲囊中包含肝臟，而肝臟被認(rèn)為是生物體代謝解毒的主要器官［19］。

4d恢復(fù)實(shí)驗(yàn)后，0.18mg·L－1濃度組鰓和消化盲囊中 MDA含量均恢復(fù)到對照組水平，而0.32和0.51mg·L－1濃度組MDA含量仍高于對照組。表明實(shí)驗(yàn)條件下低濃度WSF對扇貝機(jī)體產(chǎn)生的損傷是可逆的，而高濃度WSF對扇貝機(jī)體的損傷不可逆，這與陳家長［10］的研究結(jié)果一致。

本文研究結(jié)果顯示，特定時(shí)間內(nèi)鰓和消化盲囊中SOD、CAT活性和MDA含量均與WSF濃度存在相關(guān)性，其中消化盲囊SOD活性與WSF濃度之間的相關(guān)性在較長時(shí)間內(nèi)存在，表明消化盲囊中SOD活性較其它指標(biāo)更可能作為監(jiān)測石油污染的有效生物標(biāo)志物。

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