李新偉，趙陽(yáng)國(guó)，2＊＊，王千里，陳 敏

（中國(guó)海洋大學(xué)1.環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院；2.海洋環(huán)境與生態(tài)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島266100）

近年來，隨著海上運(yùn)輸以及沿海煉油工業(yè)的發(fā)展，溢油和漏油事故逐年增多，使受污染的海域范圍不斷擴(kuò)展，給自然海洋生態(tài)環(huán)境安全帶來巨大挑戰(zhàn)。石油泄漏和烴類污染物的排海處置會(huì)直接導(dǎo)致近岸海域環(huán)境質(zhì)量的嚴(yán)重下降，對(duì)水產(chǎn)和旅游業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失［1－3］。已有研究證實(shí)［4－6］，石油降解中間產(chǎn)物由于其潛在毒性和生物積累效應(yīng)還會(huì)引起沉積物中生物多樣性降低、微生物活性下降等連鎖性的生態(tài)學(xué)問題，其生態(tài)危害性已經(jīng)引起國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛注意。石油進(jìn)入海洋后，石油中的一些成分可直接揮發(fā)而進(jìn)入空氣；一小部分海洋表面的石油受紫外線作用可發(fā)生光化學(xué)分解，但速度極慢；而大部分石油要通過物理化學(xué)作用、微生物的降解作用形成石油乳狀液和石油代謝中間代謝產(chǎn)物，擴(kuò)散進(jìn)入新水體或沉積物，通過微生物的進(jìn)一步代謝活動(dòng)得到降解［7］。然而，一旦近海水體環(huán)境發(fā)生變化，沉積在底泥中的難降解有機(jī)物會(huì)重新釋放出來進(jìn)入水體，影響上覆水的水質(zhì)，形成二次污染。此外，底泥又是底棲生物的主要生活場(chǎng)所和食物來源，污染物質(zhì)可直接或間接對(duì)底棲生物或上覆水生物產(chǎn)生致毒致害作用，并通過生物富集、食物鏈放大等過程，進(jìn)一步影響陸地生物和人類健康［8－9］。

海洋沉積物的污染評(píng)價(jià)一直以來是人們非常關(guān)注但難以解決的問題［10］。有研究表明，可以通過生物組織殘毒和沉積物毒性測(cè)定鑒別沉積物“對(duì)人體健康或環(huán)境的危害”［11］。作為單細(xì)胞原核微生物的細(xì)菌類群，具有對(duì)環(huán)境因素改變快速響應(yīng)的特點(diǎn)，其群落結(jié)構(gòu)、功能的變異是反映沉積物污染的良好指標(biāo)。Tim等［12］研究了重金屬等污染物對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，沉積物中金屬污染物向水體的轉(zhuǎn)移依賴于沉積物中微生物群落的生物學(xué)活性，而這種微生物群落可作為海洋污染的指標(biāo)。Shane等［13］和Yakimov等［14］研究了石油類污染物對(duì)海底沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的影響，結(jié)果表明，石油烴類物質(zhì)使沉積物內(nèi)源微生物的石油代謝活性增強(qiáng)，而使微生物群落多樣性降低，這種變化可以作為石油污染狀況的生物指標(biāo)。微生物體內(nèi)參與氧化反應(yīng)的酶可分為氧化酶和脫氫酶2大類，其中脫氫酶在石油降解過程中尤為重要［15］。微生物降解石油烴的過程中，石油烴通過脫氫酶活化氫原子并傳遞給特定的受氫體，實(shí)現(xiàn)石油烴的氧化和轉(zhuǎn)化［16］。脫氫酶活性（dehydrogenase activity，DHA）可直接反映微生物降解石油的能力。該值越大表明微生物利用石油烴的能力越強(qiáng)，降解石油烴的速度越快［17］。為此，脫氫酶活性可以用來表征微生物降解石油的功能指標(biāo)。

膠州灣是黃海西北邊緣順承陸海的過渡海灣，其石油污染日益嚴(yán)峻，作為污染的生態(tài)影響評(píng)價(jià)指征，沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能及對(duì)石油污染的響應(yīng)特征亟需深入研究。基于此，本研究以膠州灣沉積物為對(duì)象，并模擬海底環(huán)境建立動(dòng)態(tài)微宇宙模型，通過檢測(cè)脫氫酶活性和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，來探討石油烴污染物對(duì)沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)的可能影響以及微生物的響應(yīng)，為海洋沉積物石油污染的生態(tài)學(xué)影響評(píng)價(jià)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 沉積物的采集

2008年9月29日，應(yīng)用沉積物原位采集器自膠州灣李村河口附近（120.312 5°E，36.156 4°N）獲取沉積物樣品，沉積物采集后置于50L塑料筒中混合均勻，運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室用于海洋沉積物模擬研究。沉積物基本特征為：總磷522.6mg·kg－1，總氮1 800mg·kg－1，有機(jī)氮0.18%，有機(jī)碳1.03%，有機(jī)質(zhì)5.07%。

1.2 動(dòng)態(tài)微宇宙模型的建立

建立2個(gè)動(dòng)態(tài)微宇宙模型，用于揭示膠州灣沉積物在石油烴污染條件下，沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的變化。模型材質(zhì)為有機(jī)玻璃，圓筒狀，直徑80mm，高240mm，總?cè)莘e1.2L，有效容積1.0L。模型中，加入0.3L穩(wěn)定的膠州灣沉積物樣品，上層覆蓋取自膠州灣的陳海水。

模型采用底部進(jìn)水、頂部出水的方式。1個(gè)模型為空白對(duì)照，進(jìn)水只進(jìn)陳海水；另1個(gè)模型進(jìn)水為加入終濃度1 000mg·L－1乳化石油的陳海水。其中陳海水為取自膠州灣中央受陸地影響較小區(qū)域的海水，將其放置暗處貯存數(shù)周，待其所含雜質(zhì)沉淀后，過濾而得到的海水。為模擬外源污染物對(duì)膠州灣沉積物的沖蝕作用以及潮汐作用，模型運(yùn)行過程中頂部設(shè)有一攪拌器。模型的控制以24h為一周期，其過程為：首先攪拌器攪拌1h，然后靜置1h，之后蠕動(dòng)泵開始進(jìn)水，進(jìn)水流速為0.5mL·min－1，進(jìn)水8h后，蠕動(dòng)泵停止運(yùn)行。此時(shí)開啟攪拌器，攪拌1h，再靜置沉降1h后進(jìn)水，12h后停止進(jìn)水。

本研究的石油污染物是原油和少量吐溫－80的混合物。原油直接取自盤錦遼河油田，在加入進(jìn)水前將石油與吐溫－80按10∶3（w／w）比例乳化，然后加入到進(jìn)水中，配成石油濃度為1 000mg·L－1的進(jìn)水。吐溫－80可有效分散原油液滴以強(qiáng)化與微生物接觸，低濃度時(shí)（500mg·L－1）可協(xié)同促進(jìn)微生物對(duì)多環(huán)芳烴的降解［18］。

每隔5d取模型的出水和底泥，一部分泥樣和水樣裝于封口袋中，立即用于脫氫酶活性測(cè)定和細(xì)菌總數(shù)分析；另取3～5mL沉積物樣品，－20℃保存，用于微生物分子生物學(xué)分析。

1.3 沉積物微生物群落結(jié)構(gòu)與功能分析

1.3.1 脫氫酶活性（DHA） 微生物降解石油烴的過程中，石油烴通過脫氫酶活化氫原子并傳遞給特定的受氫體，實(shí)現(xiàn)石油烴的氧化和轉(zhuǎn)化，DHA可直接反映微生物降解石油的能力［15］。本研究采用氯化三苯基四氮唑（TTC）比色法測(cè)定石油降解過程中沉積物微生物脫氫酶活性［19］。定義每1mL菌液、1h氧化1μg三苯基甲臜（TPF）所需的酶量為1個(gè)酶活單位，單位是μg·g－1。

1.3.2 細(xì)菌定量分析 將稀釋的沉積物樣品按9∶1（v／v）加入甲醛對(duì)細(xì)菌進(jìn)行固定，用 DAPI（4’，6－diamidino－2－phenylindole，4’，6－聯(lián)脒－2－苯基吲哚）染色，熒光顯微技術(shù)測(cè)定細(xì)菌總數(shù)。DAPI是1種靈敏度高、特異性強(qiáng)的熒光染料，對(duì)染色體及DNA有很好的染色效果。它可與DNA的A－T堿基結(jié)合形成DAPI－DNA復(fù)合物，該復(fù)合物在紫外激發(fā)光（365nm）下會(huì)發(fā)出藍(lán)色熒光。甲醛固定的樣品經(jīng)DAPI染色時(shí)，甲醛可誘發(fā)蛋白質(zhì)中的芳香乙?；鶊F(tuán)轉(zhuǎn)化為熒光色團(tuán)，從而使細(xì)胞質(zhì)熒光較強(qiáng)，由此可見整個(gè)細(xì)胞的輪廓［20］。根據(jù)文獻(xiàn)［21］的計(jì)算公式，計(jì)算原樣品中細(xì)菌總數(shù)。

1.3.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析 采用高效土壤DNA提取試劑盒（Mobio，美國(guó)）提取沉積物總DNA。以總DNA為模板，應(yīng)用細(xì)菌通用引物 BA101／BA534［22］對(duì)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析；以BA101／BA534擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，以細(xì)菌通用引物BA341／BA534［23］對(duì)石油影響下的細(xì)菌群落進(jìn)行嵌套PCR，以進(jìn)一步解析該條件下的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)動(dòng)態(tài)。用于DGGE分析的PCR產(chǎn)物，其引物BA534的5’端均帶有GC夾，所用引物均購(gòu)自上海Invitrogen，PCR擴(kuò)增在Mycycle擴(kuò)增儀（Bio－Rad Laboratories，美國(guó)）上進(jìn)行。根據(jù)文獻(xiàn)［22］的方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增及對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DGGE分析。

應(yīng)用 Gel－Pro 4.5對(duì) DGGE圖譜進(jìn)行數(shù)字化，提取各條帶的灰度值。根據(jù)數(shù)字化結(jié)果對(duì)DGGE圖譜中各泳道微生物進(jìn)行Shannon－Weiner多樣性指數(shù)（H′）分析，H′通過公式H′＝－∑Pi logPi計(jì)算，其中Pi是泳道中條帶的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度；采用SPSS軟件（SPSS Inc.，Chicago IL）以 Ward’s方法對(duì)各泳道群落進(jìn)行聚類分析。

DGGE圖中條帶按文獻(xiàn)［22］方法回收并克隆測(cè)序。序列通過 RDP（http：／／rdp.cme.msu.edu／）中的SeqMatch程序以及Blast在線工具進(jìn)行相似性檢索。

1.4 DNA序列在基因庫(kù)中的登錄號(hào)

本研究獲得DGGE條帶序列均已經(jīng)遞交至Gen－Bank中，登錄號(hào)為：JQ316483－JQ316495。

2 結(jié)果與討論

2.1 沉積物中細(xì)菌數(shù)量的變化

應(yīng)用熒光計(jì)數(shù)法對(duì)不同時(shí)期的沉積物細(xì)菌總數(shù)進(jìn)行定量分析（見圖1）。模型運(yùn)行初期，由于上覆水中加入高濃度的石油，大量的細(xì)菌由于環(huán)境的迅速改變以及石油的高毒性而死亡或受到抑制，表現(xiàn)為細(xì)菌總數(shù)迅速降低。此后，細(xì)菌總數(shù)一直在3.0×109cell·g－1范圍內(nèi)波動(dòng)，變化不大，表明沉積物中細(xì)菌群落經(jīng)過10d左右的馴化，已經(jīng)基本趨于穩(wěn)定。

模型運(yùn)行至第70天左右，其微生物總數(shù)有降低的趨勢(shì)，可能由于時(shí)間的推移，石油降解中間產(chǎn)物不斷積累，對(duì)微生物產(chǎn)生了強(qiáng)烈的毒害作用，使得其微生物總數(shù)降低。Vania等［24］研究了甲苯和苯在生物降解前后對(duì)網(wǎng)紋水蚤（Ceriodaphnia dubia）的毒害作用，發(fā)現(xiàn)降解前濃度為20mg·L－1的甲苯和苯對(duì)網(wǎng)紋水蚤的致死率分別為99%和48%，降解掉98%后對(duì)其致死率分別為33%和24%，可見生物降解并不能完全去除甲苯和苯的毒性。還有研究表明，在降解過程中生成的中間產(chǎn)物的毒性反而比石油污染物的毒性更大［25］。宋玉芳等［26］對(duì)沈陽(yáng)東部石油污水灌渠的上、中、下游進(jìn)行了污染物（Cd、礦物油）含量分析和生態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明對(duì)微生物的毒性不僅來源于石油污染物本身，還來源于石油污染物降解過程中的中間產(chǎn)物。

圖1 細(xì)菌總數(shù)隨時(shí)間變化過程Fig.1 The dynamics of total bacteria in the sediment samples

2.2 沉積物脫氫酶活性對(duì)石油污染的響應(yīng)

微生物數(shù)量在一定程度上并不能準(zhǔn)確反映微生物活性狀況，利用微生物活性指標(biāo)評(píng)價(jià)生物活性是十分必要的。微生物體內(nèi)含有各種各樣的酶，能夠催化石油烴進(jìn)行氧化反應(yīng)，參加生物氧化的重要酶為氧化酶和脫氫酶二大類，其中脫氫酶類尤為重要［15］。微生物脫氫酶是微生物降解有機(jī)污染物、獲得能量的必需酶。生物體的脫氫酶活性（DHA）在很大程度上反映了生物體的活性狀態(tài)［27］。脫氫酶使石油烴的氫原子活化并傳遞給特定的受氫體，實(shí)現(xiàn)石油烴的氧化和轉(zhuǎn)化。石油中包含有數(shù)千種不同有機(jī)分子，其主要元素是碳和氫，也含有少量的氮、氧、硫元素。在微生物作用下，其中的直鏈烷烴首先被氧化成醇，源于烷烴的醇在醇脫氫酶的作用下，被氧化為相應(yīng)的醛，醛則通過醛脫氫酶的作用氧化成脂肪酸［24］。本實(shí)驗(yàn)過程中沉積物脫氫酶活性（DHA）變化見圖2。

圖2 脫氫酶活性隨時(shí)間的動(dòng)態(tài)變化Fig.2 The dynamics of DHA in the simulative sediment samples

圖2 表明，隨著石油的加入，沉積物中的脫氫酶活性明顯升高，在實(shí)驗(yàn)初期，模型中的脫氫酶活性增長(zhǎng)緩慢，模型運(yùn)行到第40天左右，脫氫酶活性呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，沉積物逐漸受到石油烴刺激，烴類污染物能使具備降解能力的微生物逐漸富集［19］，石油降解菌可以利用沉積物中易降解的石油烴組分作為碳源生長(zhǎng)，刺激石油降解菌大量繁殖，引起沉積物中的脫氫酶活性升高。比較圖1和2可以看出，在脫氫酶活性增長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期，細(xì)菌總量稍有增多，但并不明顯，這表明石油烴利用活性的升高與細(xì)菌總量的提高并不同步，主要是由于沉積物中石油降解菌數(shù)（均值為7.0×104個(gè)·g－1·dw）只占細(xì)菌總數(shù)（均值1.08×109個(gè)·g－1dw）中少部分，在這種情況下，即使石油烴降解菌的數(shù)量和活性有較大的提升，也無法在總菌數(shù)量上表現(xiàn)出來［28］。但到第75天左右脫氫酶活性開始有所降低，可能由于石油中間代謝產(chǎn)物的長(zhǎng)時(shí)間積累，毒性逐漸加強(qiáng)。研究表明，在降解過程中生成的中間產(chǎn)物的毒性反而比石油污染物的毒性更大［25］，這就導(dǎo)致石油降解菌逐漸受到抑制甚至死亡。

2.3 石油污染條件下沉積物細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的響應(yīng)

分別取模型運(yùn)行的第0、10、25、55、85天沉積物樣品進(jìn)行DGGE分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，對(duì)照細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)并未隨著時(shí)間而發(fā)生明顯變化，而石油處理樣品在第10、25天有較大變化（圖未提供）。為了更好地顯示這些差異，又應(yīng)用嵌套PCR，將石油處理樣品的種群差異進(jìn)行放大，并進(jìn)行DGGE分析。石油處理樣品的DGGE圖譜及對(duì)圖譜進(jìn)行聚類分析結(jié)果如圖3，對(duì)DGGE圖中部分條帶進(jìn)行克隆測(cè)序分析，結(jié)果如表1。

由圖3－B聚類分析，可以看出第0天和第10天群落結(jié)構(gòu)相似性較高，第55天和85天菌落結(jié)構(gòu)相似性較高，隨著石油的不斷馴化，沉積物中的群落結(jié)構(gòu)不斷發(fā)生變化，前10天與后期群落結(jié)構(gòu)的分離距離可達(dá)50%，表明石油烴對(duì)沉積物樣品細(xì)菌群落的選擇作用主要發(fā)生在模型運(yùn)行初期，而隨著模型的運(yùn)行，這種選擇作用逐漸減小。

圖3 不同時(shí)期泥樣的DGGE譜圖（A）及其聚類分析（B）Fig.3 DGGE profile of samples at different times（A）and cluster analysis for DGGE profiles（B）

從圖3－A 中可以看出，條帶 A1、A2、A8、A11、A12、A13逐漸消失，表明這些條帶由于不適應(yīng)石油環(huán)境而逐漸被淘汰；而相反，條帶 A3、A4、A5、A7、A10隨著模型的運(yùn)行，其濃度逐漸加強(qiáng)，并成為優(yōu)勢(shì)類群，表現(xiàn)出對(duì)石油環(huán)境的適應(yīng)，同時(shí)其功能也可能得到發(fā)揮。根據(jù)測(cè)序結(jié)果的分析，這5個(gè)優(yōu)勢(shì)條帶，序列分別同γ－變形菌綱（3條）、δ－變形菌綱（1條）和厚壁菌門（1條）中的微生物最為相似，多為分離自海洋中的非典型石油烴降解菌。可見，不同微生物對(duì)石油污染環(huán)境的適應(yīng)能力是有差別的，沉積物被石油烴污染以后，烴類污染物能使具有降解能力的微生物產(chǎn)生誘導(dǎo)酶，正是通過這種自然選擇以及基因突變作用，能夠適應(yīng)新的微生物生態(tài)環(huán)境的微生物種屬，在降解烴類物質(zhì)的過程中被逐漸富集成為優(yōu)勢(shì)菌群［20］。

通過對(duì)各泳道群落的多樣性分析，發(fā)現(xiàn)群落的多樣性是逐漸下降的，由最初的2.967降至2.154。這表明，由于石油污染進(jìn)入，將引起原有沉積物微生物群落多樣性的降低而特異類群的富集，這將導(dǎo)致生態(tài)系統(tǒng)組成過于單一，趨于不穩(wěn)定。

根據(jù)對(duì)DGGE條帶序列的分析，發(fā)現(xiàn)沉積物中以變形菌門（Proteobacteria）為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)類群，占全部測(cè)得序列的60%左右。其中37%為γ－變形菌綱，23%為δ－變形菌綱。模型中加入石油后，這些有機(jī)化能異養(yǎng)菌，逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌。其次是擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）和綠彎菌門（Chloroflexi）等相關(guān)序列。其中擬桿菌門（Bacteroidetes）屬于革蘭氏陰性菌，是兼性厭氧生物，絕大多數(shù)種屬在有機(jī)物的發(fā)酵降解過程中具有重要作用。放線菌門（Actinobacteria）和厚壁菌門（Firmicutes）都屬于革蘭氏陽(yáng)性菌，其中很多厚壁菌可以產(chǎn)生芽胞，它可以抵抗脫水和極端環(huán)境。

表1 通過BLAST和SeqMatch進(jìn)行的相似性檢索結(jié)果Table 1 Sequence similarities to closest relatives and phylogenetic affiliations of DNA recovered from DGGE gel

續(xù)表

測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)，本研究中膠州灣沉積物降解石油的微生物類群，與陳碧娥等［29］湄洲灣海域降解石油烴的天然菌群結(jié)構(gòu)較為相似。另外，Margesin等［6］降解柴油的微生物研究以及周宗澄等［30］報(bào)道的廈門港石油降解菌的研究，發(fā)現(xiàn)其優(yōu)勢(shì)菌群主要為革蘭氏陰性菌，也與本研究結(jié)果較為一致。

3 結(jié)語(yǔ)

采用脫氫酶活性分析和DGGE技術(shù)，探討了沉積物上覆水中添加石油后沉積物中微生物功能和群落結(jié)構(gòu)的響應(yīng)特征，表明高濃度的石油污染對(duì)細(xì)菌總量無顯著影響，但脫氫酶活性卻會(huì)明顯提高；石油烴污染可引起沉積物中特異微生物類群的過度富集，并導(dǎo)致微生物多樣性明顯下降。

［1］ Bode A，Gonzalez N，Lorenzo J，et al.Enhanced bacterioplankton activity after the‘Prestige’oil spill of Galicia，NW Spain［J］.A－quatic Microbial Ecology，2006，43：33－41.

［2］ MacNaughton S J，Stephen J R，Venosa A D，et al.Microbial population changes during bioremediation of an experimental oil spill［J］.Applied and Environmental Microbiology，1999，65（8）：3566－3574.

［3］ Saul D J，Aislabie J M，Brown C E，et al.Hydrocarbon contamination changes the bacterial diversity of soil from around Scott Base，Antarctica［J］.FEMS Microbiology Ecology，2005，53（1）：141－155.

［4］ 王修林，鄧寧寧，李克強(qiáng)，等.渤海海域夏季石油烴污染狀況及其環(huán)境容量估算［J］.海洋環(huán)境科學(xué)，2004，23（4）：14－18.

［5］ 盧冰，熊健，鄭士龍.象山港海域中石油烴含量分布特征及評(píng)價(jià)［J］.東海海洋，1993，11（4）：67－74.

［6］ Margesin R，Hammerle M，Tscherko D.Microbial activity and community composition during bioremediation of diesel－oil－contaminated soil：effects of hydrocarbon concentration，fertilizers，and incubation time［J］.Microbial Ecology，2007，53（2）：259－269.

［7］ 譚田豐，邵宗澤.海洋石油烴降解菌群構(gòu)建及其在降解過程中的動(dòng)態(tài)分析［J］.廈門大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2006，45（S1）：262－266.

［8］ 劉文新，湯鴻霄，區(qū)域沉積物質(zhì)量基準(zhǔn)常用建立方法的改進(jìn)與優(yōu)化［J］.中國(guó)環(huán)境科學(xué)，1997，17（3）：220－224.

［9］ 范文宏，陳靜生.沉積物重金屬生物毒性評(píng)價(jià)的研究進(jìn)展［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2002，25（1）：36－48.

［10］ 朱廣超.連云港海岸沉積物中微生物群落結(jié)構(gòu)與功能的初步研究［D］.無錫：江南大學(xué)，2009.

［11］ Yunker M B，Cretney W J.Bioavailability of chlorinated dibenzop－dioxins and dibenzofurans to dungeness crab（Cancer magister）at marine pulp mill sites in British Columbia，Canada［J］.Envrionmental Toxicology and Chemistry，2000，19（12）：2997－3011.

［12］ Ford T，Sorci J，Ika R，et al.Interactions between metals and microbial communities in New Bedford harbor，Massachusetts［J］.Environmental Health Perspectives，1998，106（4）：1033－1039.

［13］ Powell S M，Bowman J P，Snape I，et al.Microbial community variation in pristine and polluted near shore Antarctic sediments［J］.FEMS Microbiology Ecology，2003，45（2）：135－145.

［14］ Yakimov M M，Denaro R，Genovese M，et al.Natural microbial diversity in superficial sediments of Milazzo Harbor（Sicily）and community successions during microcosm enrichment with various hydrocarbons［J］.Environmental Microbiology，2005，7（9）：1426－1441.

［15］ 楊樂，李春，魯建江，等.石油降解菌的篩選及其降解能力的初步研究［J］.石河子大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，25（4）：484–487.

［16］ 李廣賀，張旭，盧曉霞.土壤殘油生物降解性與微生物活性［J］.地球科學(xué)－中國(guó)地質(zhì)大學(xué)學(xué)報(bào).2002，27（2）：181－185.

［17］ 陳碧娥，王麗娜.營(yíng)養(yǎng)鹽對(duì)湄洲灣海洋細(xì)菌生長(zhǎng)及降解石油烴的影響［J］.海洋環(huán)境科學(xué)，2005，24（4）：52－54.

［18］ 臧淑艷，李培軍，楊艷杰.Tween 80作用下苯并［a］芘的微生物降解研究［J］.遼寧工程技術(shù)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，26（3）：467－469.

［19］ Gong P.Dehydrogenase activity in soil：a comparison between the TTC and INT assay under their optimum conditions［J］.Soil Biology ＆Biochemistry，1997，29（2）：211－214.

［20］ 孟昭翠，類彥立，和瑩瑩，等.樣品保藏方式與時(shí)間對(duì)海洋底棲細(xì)菌及原生生物熒光計(jì)數(shù)效能的影響［J］.海洋科學(xué)，2010，34（5）：13－19.

［21］ Kepner R L Jr，Pratt J R.Use of fluorochromes for direct enumeration of total bacteria in environmental samples：past and present［J］.Microbiological Reviews，1994，58：603－615.

［22］ 高崇洋，趙陽(yáng)國(guó)，王愛杰，等.耕作和施肥對(duì)不同深度黑土中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響［J］.微生物學(xué)報(bào).2010，37（1）：67－75.

［23］ Muyzer G，de Waal E C，Uitterlinden A G.Profiling of complex microbial populations by denaturing gradient gel electrophoresis analysis of polymerase chain reaction－amplified genes coding for 16SrRNA ［J］.Applied and Environmental Microbiology，1993，59：695－700.

［24］ da Silva Nunes－Halldorson V，Steiner R L，Smith G B.Residual toxicity after biodegradation：interaction among benzene，toluene，and chloroform ［J］.Ecotoxicology and Environmental Safety，2004，57（2）：162－167.

［25］ 郭娟.強(qiáng)化微生物修復(fù)石油污染沉積物實(shí)驗(yàn)研究［D］.西安：西安建筑科技大學(xué)，2008.

［26］ 宋玉芳，周啟星，宋雪英，等.石油污灌土壤污染物的殘留與生態(tài)毒理［J］.生態(tài)學(xué)雜志，2004，23（5）：61－66.

［27］ 陳翔.脫氫酶在環(huán)境監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用概況.解放軍預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志［J］，1997，15（6）：459－462.

［28］ 孫佳.大西洋、太平洋和印度洋微生物數(shù)量、生物量、多樣性及其生態(tài)特征［D］.廈門：國(guó)家海洋局第三海洋研究所，2008.

［29］ 陳碧娥，郭厚寶，蘇榮西，等.媚洲灣天然菌群對(duì)石油烴的降解作用［J］.華僑大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，21（2）：182－187.

［30］ 周宗澄，倪純治，李志棠，等.海洋污染微生物降解的研究［J］.海洋學(xué)報(bào)，1983，5（6）：637－644.