歐陽晶，陳汝雪，牟 瑛

氨磷汀(amifostine，WR-2721)是一種細(xì)胞保護(hù)劑，對正常組織具有保護(hù)作用［1-2]。但是 WR-2721在一定的劑量時也具有一定的毒性作用［3-5]，臨床上WR-2721的主要不良反應(yīng)為低血壓、過敏性皮疹、發(fā)熱、休克和血鈣降低等［6-7]。筆者的前期實(shí)驗(yàn)研究表明，多糖能減少WR-2721對體外細(xì)胞造成的毒性。本實(shí)驗(yàn)采用MTT法檢測細(xì)胞的存活率，采用比色法測定細(xì)胞丙二醛(MDA，malonyldialdehyde)含量，流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡，以觀察香菇多糖與WR-2721聯(lián)合應(yīng)用對Hela細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

Hela細(xì)胞株，由本院提供;香菇多糖，湖北創(chuàng)力藥業(yè)有限公司;WR-2721，湖北葛店人福藥業(yè)有限公司;DMEM(dulbecco's minimum essential medium)培養(yǎng)基，美國GIBCO公司;小牛血清，杭州四季青生物工程公司;MTT，PI，Sigma公司;MDA試劑盒，南京建成生物工程研究所;Triton X-100，Amersco公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hela細(xì)胞培養(yǎng)于含10%小牛血清DMEM培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對數(shù)生長期。

1.2.2 香菇多糖對Hela細(xì)胞生長的影響 取對數(shù)生長期Hela細(xì)胞(3×104/ml)，接種于96孔培養(yǎng)板中，置37℃，5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，加入香菇多糖溶液，終濃度分別為0、25、125、250、500、1000、2000 mg/L，每個濃度設(shè) 4 個孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。小心棄去上層培養(yǎng)液，加入150μl以DMEM培養(yǎng)基配制的MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上層培養(yǎng)液，加入150μl DMSO，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀在570 nm處測定OD值。按下列公式計算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(%)=(實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值)×100%

1.2.3 香菇多糖對WR-2721處理的Hela細(xì)胞生長的影響 細(xì)胞處理方法同1.2.2，設(shè)空白對照組、WR-2721組、香菇多糖 +WR-2721聯(lián)合給藥組。WR-2721終濃度為500 mg/L，香菇多糖的終濃度分別為 0、25、125、250、500、1000、2000 mg/L。

1.2.4 香菇多糖對WR-2721處理的Hela細(xì)胞MDA的影響 取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，用DMEM培養(yǎng)液調(diào)至3×104/ml，接種于6孔培養(yǎng)板中。置37℃，5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12～16 h，設(shè)空白對照組、WR-2721組及香菇多糖+WR-2721聯(lián)合給藥組，WR-2721終濃度為500 mg/L，香菇多糖終濃度分別為50、200、1000 mg/L，每個濃度設(shè)4個孔。繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用1.5 ml PBS吹打制成細(xì)胞懸液移入離心管，反復(fù)凍融3次，用超聲細(xì)胞破碎儀在冰浴中完全破碎細(xì)胞(20 kHz，10 min)，4℃離心，取上清液，按試劑盒說明書測定MDA含量。

1.2.5 香菇多糖對WR-2721處理的Hela細(xì)胞凋亡的影響 取對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞，以5×104/ml的密度接種，培養(yǎng)16 h后，設(shè)空白對照組、WR-2721組和香菇多糖+WR-2721聯(lián)合給藥組，WR-2721終濃度為500 mg/L，香菇多糖終濃度為125、1000 mg/L，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，胰酶消化成單細(xì)胞懸液，用冰PBS洗滌2次，800 r/min離心5 min，離心半徑為85 mm，棄上清，緩慢加入－20℃預(yù)冷的70%乙醇，4℃過夜。取細(xì)胞懸液，PBS洗滌，1600 r/min離心5 min后，棄上清。PI染色液1 ml染色30 min，混合液經(jīng)過300目濾網(wǎng)以除去雜質(zhì)，流式細(xì)胞術(shù)測定細(xì)胞的凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 香菇多糖對Hela細(xì)胞生長的影響

與空白對照組(多糖劑量為0)比較，各濃度的香菇多糖組差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示香菇多糖對Hela細(xì)胞無明顯不良作用。見表1。

表1 不同濃度香菇多糖對Hela細(xì)胞生長的影響(±s)

表1 不同濃度香菇多糖對Hela細(xì)胞生長的影響(±s)

多糖劑量(mg/L) 細(xì)胞存活率(%)0 100.0 ±1.3 25 99.8 ±1.6 125 100.8 ±3.8 250 98.9 ±1.3 500 104.8 ±3.0 1000 106.9 ±11.5 2000 100.0 ±2.3

2.2 香菇多糖對WR-2721處理Hela細(xì)胞生長的影響

WR-2721處理組Hela細(xì)胞存活率為41.4%，香菇多糖在1000、2000 mg/L時，Hela細(xì)胞存活率分別為63.0%和58.5%，與WR-2721組比較均非常顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。提示高濃度香菇多糖對WR-2721的細(xì)胞毒性有顯著的防護(hù)作用。見表2。

表2 香菇多糖對WR-2721處理Hela細(xì)胞生長的影響(±s)

表2 香菇多糖對WR-2721處理Hela細(xì)胞生長的影響(±s)

注:與空白對照組比較a P＜0.01;與WR-2721組比較b P＜0.01

組別 WR-2721(mg/L)香菇多糖(mg/L)細(xì)胞存活率(%)空白對照組0 0 100.0 ±1.5 WR-2721 組 500 0 41.4 ±2.2a聯(lián)合給藥組 500 25 39.1 ±2.0a 500 125 41.5 ±2.1a 500 250 46.0 ±0.1a 500 500 41.1 ±4.6a 500 1000 63.0 ±2.4ab 500 2000 58.5 ±5.4ab

2.3 香菇多糖對WR-2721處理Hela細(xì)胞MDA的影響

不同濃度的香菇多糖溶液與WR-2721聯(lián)合應(yīng)用，與空白對照組及單用 WR-2721組比較，細(xì)胞MDA差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。提示香菇多糖、WR-2721及兩者聯(lián)合應(yīng)用對Hela細(xì)胞的MDA含量均沒有明顯影響。見表3。

表3 香菇多糖與WR-2721聯(lián)合使用對Hela細(xì)胞MDA的影響±s)

表3 香菇多糖與WR-2721聯(lián)合使用對Hela細(xì)胞MDA的影響±s)

組別 WR-2721(mg/L)香菇多糖(mg/L)MDA(nmol/ml)空白對照組0 0 2.15 ±0.16 WR-2721 組 500 0 2.31 ±0.24聯(lián)合給藥組 500 50 2.21 ±0.31 500 200 2.17 ±0.32 500 1000 2.26 ±0.27

2.4 香菇多糖對WR-2721處理Hela細(xì)胞凋亡的影響

WR-2721處理后Hela細(xì)胞的凋亡率明顯增加;不同濃度香菇多糖處理組細(xì)胞的凋亡率均明顯低于WR-2721組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01)。提示香菇多糖能抑制WR-2721引起的Hela細(xì)胞凋亡。見表4。

表4 香菇多糖與WR-2721聯(lián)合使用對Hela細(xì)胞凋亡的影響±s)

表4 香菇多糖與WR-2721聯(lián)合使用對Hela細(xì)胞凋亡的影響±s)

注:與空白對照組比較a P＜0.01;與WR-2721組比較b P＜0.01

組別 WR-2721(mg/L)香菇多糖(mg/L)凋亡率(%)空白對照組0 0 17.3 ±0.7 WR-2721 組 500 0 27.5 ±0.9a聯(lián)合給藥組 500 125 24.3 ±1.1ab 500 1000 23.5 ±0.6ab

3 討論

WR-2721是一種輻射損傷防護(hù)劑，在臨床上主要用于輻射損傷的治療，也用作化療、放療的保護(hù)劑，但WR-2721本身有較強(qiáng)的毒性作用。本研究發(fā)現(xiàn)，以終濃度為500 mg/L的WR-2721處理Hela細(xì)胞后，細(xì)胞存活率下降至41.4%，凋亡率達(dá)27.5%，與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，說明一定濃度的WR-2721對細(xì)胞有毒性作用。

國內(nèi)外大量研究表明，電離輻射可以誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡和氧化損傷［8-10]。MDA是氧化損傷的經(jīng)典指標(biāo)，機(jī)體通過非酶系統(tǒng)作用于生物膜中的不飽和脂肪酸，引起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，生成大量的代謝產(chǎn)物MDA，常用MDA來反映組織脂質(zhì)過氧化損傷的程度，也用來評價輻射防護(hù)藥物對機(jī)體的保護(hù)作用［11-12]。本研究顯示，香菇多糖、WR-2721及兩者聯(lián)合應(yīng)用均不會引起細(xì)胞產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。

細(xì)胞凋亡在維持組織正常形態(tài)及功能方面起重要作用。香菇多糖濃度為125～1000 mg/L時，與WR-2721聯(lián)合使用后，其凋亡率最低達(dá)19.8%，顯示香菇多糖可顯著減少WR-2721所致的Hela細(xì)胞凋亡，說明一定濃度的WR-2721對體外培養(yǎng)細(xì)胞具有明顯的毒性，香菇多糖對WR-2721造成的細(xì)胞毒性具有防護(hù)作用。

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