潘平康 張 超 吳海琴 王虎清 張 欣

葛根為豆科植物野葛或甘葛藤的干燥根，應用歷史悠久，現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)其主要活性成分為異黃酮類化合物［1］，葛根素注射液系從豆科植物野葛或甘葛藤根中提取的一種黃酮苷，具有明顯的擴張腦血管，加快血流速度，改善腦微循環(huán)，增腦血流量，改善氧供的作用。葛根總黃酮對腦血管的擴張作用要比冠狀血管更明顯，能改善腦循環(huán)和外周循環(huán)，因此臨床上已廣泛應用于腦缺血的治療，具有明顯療效［2］。

促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是由胚胎肝臟與成人腎臟分泌的一種含唾液酸的酸性糖蛋白［3］，正常情況下在人類大腦組織內(nèi)存在內(nèi)源性EPO及EPO-R，并廣泛參與了神經(jīng)系統(tǒng)的功能。腦缺血后腦組織中EPO和EPO-R的表達水平明顯增高。EPO的表達受低氧誘導因子（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）的調(diào)節(jié)，但低氧并非是誘導EPO和EPO-R表達增加的唯一因素。信號傳導和轉(zhuǎn)錄活化因子5（signal transducer and activator of transcription 5，STAT-5）是一種能與靶基因調(diào)控區(qū)DNA結(jié)合的胞漿蛋白，在細胞生存和增殖方面起著重要的媒介作用。JAK2／STAT-5通路可能是EPO抗神經(jīng)元凋亡的主要信號傳導途徑之一。本研究應用TTC染色及免疫組化測定各組大鼠局限性腦缺血后腦梗死體積及海馬CA3區(qū)EPO和STAT-5的動態(tài)表達情況，目的在于探討葛根素對大鼠海馬中EPO和STAT-5表達水平的影響及其可能機制，為葛根素治療腦缺血的臨床應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物分組

雄性SD大鼠105只，體重250～800 g，月齡2～3個月（由西安交通大學醫(yī)學院動物中心提供），并隨機分為3組：模型干預組（n＝45）、模型對照組（n＝45）和假手術(shù)組（n＝15）。模型干預組及模型對照組根據(jù)干預時間不同又隨機分為2 h組、12 h組、24 h組，每組各15只。各模型干預組分別于分組對應的時間點給予葛根素注射液（100 mg／kg）腹腔注射，各模型對照組及假手術(shù)組給予等量生理鹽水腹腔注射。每組取5只用于TTC染色，剩余10只則行免疫組化染色觀察海馬CA3區(qū)EPO及STAT-5陽性細胞的表達情況。

1.2 主要試劑

羊抗大鼠EPO多克隆抗體購自Santa Cruz Biotechnology，Inc；兔抗大鼠STAT-5多克隆抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；SABC免疫組化試劑盒來自武漢博士德生物工程有限公司；DAB顯色試劑盒購于北京中杉生物技術(shù)有限公司；葛根素注射液為陜西安康正大制藥廠提供。

1.3 模型的建立

參考 Zea-Longar［4］和 Koizumi［5］的插線方法，采用線栓法制備大鼠大腦中動脈閉塞局灶性腦缺血模型（MCAO）；10%水合氯醛3 ml／kg腹腔注射麻醉后，作頸部正中切口，鈍性分離左側(cè)頸總動脈（CCA）、頸內(nèi)動脈（ICA）、頸外動脈（ECA）和翼腭動脈（PPA），在頸總動脈分叉處下方剪一0.2 mm的楔形切口，從切口向遠端插入備好的栓線，感到有輕微阻力時即停止，結(jié)扎固定好栓線，縫合皮膚；2 h后大鼠清醒進行神經(jīng)行為學評估。模型干預組及模型對照組均建成MCAO模型，假手術(shù)組僅鈍性分離左側(cè)CCA、ICA、ECA、PPA后即縫合皮膚。完成模型制備后各模型干預組分別于分組對應時間點給予葛根素（100 mg／kg）腹腔注射，模型對照組及假手術(shù)組均于相應時間點給予等量生理鹽水腹腔注射。

1.4 標本的采集

各組于給藥5 h后以10%水合氯醛3 ml／kg腹腔注射麻醉大鼠，開胸灌注，斷頭取腦，用直鑷從大腦基底部剝?nèi)〈竽X，從視交叉處冠狀位切為兩半，除去嗅腦、小腦和腦干，剩余腦組織置于4%多聚甲醛固定12 h，再用蒸餾水沖洗浸泡24 h，石蠟包埋。

1.5 TTC染色

給藥后5 h將大鼠麻醉迅速斷頭，剝離大腦；生理鹽水沖洗片刻，－20℃速凍5 min，然后棄去小腦和延髓，將腦從額極向后連續(xù)冠狀位切片，每2 mm一張，共5～6片；放入1%2，3，5-三苯基-2H-四唑鹽酸鹽（TTC）中，37℃搖晃恒溫孵育30 min，0.1 MPBS溶液沖洗2～3次；然后用4%多聚甲醛溶液固定24 h；正常腦組織為鮮紅色，梗死腦組織為白色；將固定的腦片按切片順序排列，拍照后掃描輸入計算機。用圖像處理軟件計算每一腦片白色區(qū)域的面積及紅色區(qū)域的面積，乘以厚度（2 mm）并將所得數(shù)值相加得相應的體積。

1.6 免疫組化染色（SP法）

將所取之腦塊自前向后行冠狀位切片，片厚約6μm，每張切片包含海馬的冠狀位切面，梯度乙醇脫蠟至水，3%（體積分數(shù)）H2O2室溫孵育40 min，微波抗原修復10 min，室溫冷卻2 h，正常血清封閉40 min，分別滴加第一抗體（羊抗大鼠EPO多克隆抗體親合純化抗體，工作濃度為1∶500；兔抗大鼠Stat-5多克隆抗體，工作濃度為1∶200），4℃過夜，生物素化二抗室溫孵育40 min，加辣根過氧化物酶標記的鏈酶卵白素工作液室溫孵育30 min，DAB顯色5 min，蘇木素復染核，脫水、透明、封片。TBS緩沖液分別代替一抗經(jīng)上述步驟染色作空白對照。每只大鼠取切片1張，光鏡下觀察HE染色大鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)以及免疫組化染色陽性細胞數(shù)，以細胞內(nèi)出現(xiàn)鮮艷的棕黃色顆粒為陽性細胞。用圖像信號采集分析系統(tǒng)測量計數(shù)每個視野（10×40倍）下陽性細胞數(shù)，每個部位隨機測5個視野，取其平均值。

1.7 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 模型制備

實驗共用大鼠123只，無癥狀5只，未到時相死亡5只，蛛網(wǎng)膜下腔出血8只，納入實驗105只，成功率為85.3%。

2.1.1 TTC染色測量腦梗死體積

用TTC染色測量腦梗死體積，模型對照組的梗死體積：2 h組為（158±12）mm3，12 h組為（178±15）mm3，24 h組為（200±26）mm3，模型干預組梗死體積：2 h組為（120±17）mm3，12 h組為（155±14）mm3，24 h組為（196±21）mm3。模型干預2 h組及12 h組的梗死體積明顯小于模型對照組各對應時間點（P＜0.05），而模型干預24 h組與模型對照24 h組比較，梗死體積雖有所縮小但不具有統(tǒng)計學意義。

2.1.2 EPO和STAT-5的表達水平

光鏡下觀察假手術(shù)組海馬的維體細胞層有散在分布的EPO和STAT-5陽性細胞，EPO以胞漿染色為主，STAT-5以胞核染色為主，模型對照組兩種蛋白陽性細胞數(shù)更多，染色更加明顯，模型干預組的形態(tài)介于兩者之間。

與模型對照組各對應時間點比較，模型干預組海馬 CA3區(qū) EPO 及STAT-5表達 減 少 （P＜0.05），但均高于假手術(shù)組（表1）。

與假手術(shù)組比較，模型對照組及模型干預組海馬CA3區(qū)EPO陽性細胞數(shù)均明顯增加（P＜0.05），2 h組EPO表達開始明顯增多，染色明顯：12 h組進一步增高，染色更加明顯；24 h組較前下降，染色變淡；STAT-5亦于相應時間點明顯表達于模型對照組及模型干預組大鼠的海馬CA3區(qū)，其蛋白表達隨時間變化的規(guī)律與EPO大致相同，而且模型對照組及模型干預組各時間點EPO和STAT-5表達水平呈同步增減變化。

表1 各組大鼠海馬CA3區(qū)EPO及STAT-5陽性細胞數(shù)比較（±s，n＝10，個／每個400倍視野）

表1 各組大鼠海馬CA3區(qū)EPO及STAT-5陽性細胞數(shù)比較（±s，n＝10，個／每個400倍視野）

注：與假手術(shù)組比較，▲P＜0.05；與模型對照組各對應時間點比較，＊P＜0.05

指標 假手術(shù)組模型干預組2 h組 12 h組 24 h組 2 h組 12 h組 24 h組模型對照組EPO陽性細胞數(shù) 40.00±2.21 46.50±3.89▲ 55.70±3.71▲ 45.20±3.42▲ 43.30±2.21▲＊ 52.30±2.21▲＊43.40±2.17▲＊STAT-5陽性細胞數(shù) 39.00±4.18 53.60±2.91▲ 56.70±2.83▲ 49.40±3.13▲ 50.50±2.91▲＊ 53.60±2.50▲＊46.40±2.95▲＊

3 討 論

促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）是一種近年來發(fā)現(xiàn)的具有多種功能的神經(jīng)遞質(zhì)，它可以通過與相應受體結(jié)合引起一系列的信號轉(zhuǎn)導，參與缺血后的腦保護。由于在腦缺血、缺氧損傷發(fā)生后，EPO的生成量成倍增加，并促進神經(jīng)元的存活，對神經(jīng)元起保護作用，所以有人認為EPO也可能是腦缺血時進行預處理的一種介質(zhì)［6］，是機體生理性自我保護機制的一個重要組成部分。EPO對腦缺血損傷的保護作用可分為直接作用和間接作用兩種類型，直接作用包括對缺氧缺血誘導細胞凋亡的抑制，拮抗興奮性氨基酸毒性、抑制NO過度合成、抗腦缺血后炎癥反應等；間接作用是指在局灶性腦梗死的過程中EPO通過誘導產(chǎn)生各種細胞因子，刺激新生血管形成，發(fā)揮神經(jīng)營養(yǎng)、神經(jīng)保護作用［7］。但其具體抗神經(jīng)元凋亡的信號轉(zhuǎn)導機制尚不完全清楚，有研究顯示EPO可能主要是通過與相應靶細胞膜表面受體（EPO-R）結(jié)合，形成二聚體，并磷酸化激活Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）（一種EPO受體細胞內(nèi)部分相關(guān)的酪氨酸激酶），使之發(fā)生自體磷酸化，繼而引發(fā)下游信號轉(zhuǎn)導，調(diào)節(jié)細胞凋亡［8］。其中STAT-5作為潛在的細胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子，是JAK2的直接作用底物，可能是該轉(zhuǎn)導過程中的關(guān)鍵因子［9］。

本實驗結(jié)果顯示，（1）腦缺血12 h內(nèi)給予葛根素干預能夠明顯減少腦梗死體積，葛根素于缺血24 h后干預腦梗死體積雖可減少，但與模型對照組比較無統(tǒng)計學意義；（2）模型干預組海馬CA3區(qū)EPO表達較模型對照組各對應時間點減少（P＜0.05），但均高于假手術(shù)組，具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）；（3）各組STAT-5蛋白的表達水平及隨時間變化的規(guī)律與EPO大致相同。

上述結(jié)果表明，腦缺血早期給予葛根素干預能夠明顯減少腦梗死體積。推測葛根素可能通過改善腦血流、拮抗興奮性氨基酸毒性作用、抗血小板聚集、改善血液高凝狀態(tài)、抑制細胞凋亡等作用［10］，促進缺血半暗帶的血流灌注，抑制細胞凋亡的發(fā)生，促使“半暗帶”向正常組織轉(zhuǎn)化，從而明顯減少梗死體積，促進神經(jīng)功能恢復。發(fā)病12h以內(nèi)可能為葛根素治療缺血性腦損傷的最佳時間窗。

模型干預組海馬CA3區(qū)的EPO及STAT-5陽性細胞數(shù)均較模型對照組明顯下降，以上研究結(jié)果進一步印證了EPO的產(chǎn)生與腦組織的供血供氧情況密切相關(guān)，并提示葛根素能夠促進缺血腦組織的血流灌注、提高缺血區(qū)氧濃度，進而使模型干預組大鼠海馬CA3區(qū)EPO及STAT-5陽性細胞數(shù)顯著低于模型對照組，從而起到神經(jīng)保護作用。本實驗同時觀察到模型干預組與模型對照組各時間點EPO和STAT-5表達同步增減變化。據(jù)此本研究推測，EPO和STAT-5在缺血性腦損傷中可能作為保護性的因子起到抗神經(jīng)細胞凋亡的作用，這與前人的研究結(jié)論相一致［11］，進而推測 EPOR-JAK2-STAT-5途徑可能也存在神經(jīng)細胞中，且葛根素有可能是通過EPOR-JAK2-STAT-5信號轉(zhuǎn)導通路途徑發(fā)揮腦缺血后抗神經(jīng)元凋亡的保護性作用。

1 鄭俊華，主編.生藥學.第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，1999.159.

2 楊存聰.西藥聯(lián)合葛根素注射液治療急性腦梗死觀察.實用中醫(yī)藥雜志，2007，23（2）：99.

3 Yang T，Emilie P，Thomas F，et al.Effect of hypoxic preconditioning on brain genomic response before And following ischemia in the adult mouse：Idetification of potential neuroprotective candidates for stroke.Neurobiology of Disease，2006，21（1）：18-28.

4 Zea LE，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke，1989，20（11）：84-91.

5 Koizumi J，Yoshida Y，Nakazawa T，et al.Experimental studies of ischemic brain edema：A new experimental model of cerebral embolish in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area.Jpn J Stroke，1986，8：1-8.

6 Dawson TM.Preconditioning-mediated neuro Protection through erythroPoietin？The Lancet，2002，359（9301）：96-97.

7 Hugo HM，Myriam B，Edwige P，et al.Neuroprotection and angiogenesis：Dual role of erythropoietin in brain ischemia.News Physiol Sci，2000，15（5）：225-229.

8 Ghezzi P.Brines M.Erythropoietin as an antiapoptotic.tissueprotective cytokine.Cell Death and Diffentiation，2004，11：S37-44.

9 Socolovsky M.Nam H，F(xiàn)leming MD，et al.Ineffective erythropoiesis in Stat5a－／－5b－／－mice due to decreased survival of early erythroblasts.Blood，2001，98（12）：3261-3273.

10 Socolovsky M，Nam H，F(xiàn)leming MD，et al.Ineffective erythropoiesis in Stat5a－／－5b－／－mice due to decreased survival of early erythroblasts.Blood，2001，98（12）：3261-3273.

11 Zhang F，Wang S，Cao G，et al.Signal transducers and activators of transcription 5 contributes to erythropoietin-mediated neuroprotection against hippocampalneuronal death after transient global cerebral ischemia.Neurobiology of Disease，2007，25（1）：45-53.