南京中醫(yī)藥大學(xué)泰州附屬醫(yī)院（225300）王威

愈喘至圣膏為醫(yī)院制劑，是肺腎雙補(bǔ)劑，其處方由28味中藥組成[黨參150g、熟地150g、陳皮100g、蘇子100g、沙參100g、黃芪300g、麻黃100g、法半夏100g、白芥子100g、大貝母100g、白術(shù)100g、茯苓150g、胡桃肉150g、紫河車150g、五味子50g、干姜40g、百部100g、款冬花100g、紫苑100g、黃精150g、蛤蚧一對(duì)、當(dāng)歸100g、桃仁100g、杏仁100g、白果150g、紅棗150g、生姜100g、淮山藥150g]，適用于肺腎兩虛，腎不納氣，痰濁蘊(yùn)肺，肺氣上逆癥。癥見：長(zhǎng)期慢性咳喘，痰涎清稀，氣短乏力，動(dòng)輒尤甚，體虛自汗，易于感冒，形寒畏冷，腰膝酸軟，甚則心悸胸悶，難以平臥，雙下肢水腫，面色晄白，舌淡脈細(xì)等。通常認(rèn)為愈喘至圣膏為中藥補(bǔ)劑，應(yīng)無(wú)抗菌作用，無(wú)須進(jìn)行微生物限度檢查方法驗(yàn)證，直接采用常規(guī)法檢查即可。本文通過(guò)愈喘至圣膏微生物限度檢查方法系統(tǒng)的方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，說(shuō)明補(bǔ)藥制劑其微生物限度檢查方法同樣需要驗(yàn)證。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 愈喘至圣膏：膏劑，規(guī)格為2.8kg/付（泰州市中醫(yī)院批號(hào)：121014，121121，121209）。

1.1.2 試驗(yàn)菌株 金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26 003]、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）[CMCC（B）63 501]、大腸埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（F）44 102]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98 001] 、黑曲霉（Aspergillus ni-ger）[CMCC（F）98003]。

1.1.3 培養(yǎng)基 膽鹽乳糖增菌液（批號(hào)：120407）、玫瑰紅鈉瓊脂（批號(hào)：120105）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂（批號(hào)：110704）、營(yíng)養(yǎng)肉湯（批號(hào)：070410）、改良馬?。ㄅ?hào)：070201）、改良馬丁瓊脂（批號(hào)：061225）。

1.1.4 儀器 試管，吸管，培養(yǎng)皿，0.45μm微孔濾膜，可重復(fù)使用的微孔過(guò)濾器，真空抽泵，濾瓶。

1.2 方法

1.2.1 菌液制備[1]①取經(jīng)37℃培養(yǎng)18～24h的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草芽孢桿菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)物1ml，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋至10-5～10-7，使成50～100CFU/ml，經(jīng)活菌計(jì)數(shù)后備用。②取經(jīng)25℃～28℃培養(yǎng)18～24h的白色念珠菌的改良馬丁培養(yǎng)物1ml，用0.9%無(wú)菌氯化溶液10倍稀釋至10-5～10-6，使成50～100CFU/ml，經(jīng)活菌計(jì)數(shù)后備用。③取經(jīng)25℃～28℃培養(yǎng)1周的黑曲霉的改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)物，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液5ml洗下黑曲霉孢子，吸出孢子懸液1ml，加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液適量稀釋至與標(biāo)準(zhǔn)比濁管濁度相當(dāng)?shù)逆咦討乙?，取此孢子懸?ml，用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液10倍稀釋到10-4，使成50～100CFU/ml，經(jīng)活菌計(jì)數(shù)后備用。

1.2.2 供試液制備 稱取樣品10g，加45℃pH7.0無(wú)菌氯化鈉－蛋白胨緩沖液100ml，混勻，得1∶10供試液 。

1.2.3 培養(yǎng)基稀釋法 取供試液1ml/皿（1∶200稀釋），0.5ml/皿（1∶400稀釋），0.2ml/皿（1∶1000稀釋），分別與50～100CFU/ml的試驗(yàn)菌注皿，然后每皿加營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基15～20ml，搖勻，待凝固后，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72h，逐日觀察結(jié)果。

附表1 培養(yǎng)基稀釋法（1∶200）的回收率試驗(yàn)結(jié)果（%）

附表2 培養(yǎng)基稀釋法（1∶400）的回收率試驗(yàn)結(jié)果（%）

附表3 培養(yǎng)基稀釋法（1∶1000）的回收率試驗(yàn)結(jié)果（%）

附表4 薄膜過(guò)濾法的回收率試驗(yàn)結(jié)果（%）

1.2.4 薄膜過(guò)濾法[1]取靜置片刻的供試液1ml，注入薄膜過(guò)濾器，加沖洗液每次50～100ml，沖洗3次，在最后一次沖洗液中加入50～100CFU/皿的枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌。濾干，取濾膜貼于相應(yīng)瓊脂平板上，置規(guī)定溫度培養(yǎng)24～72h，逐日觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

細(xì)菌培養(yǎng)48h，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，以48h的菌落數(shù)報(bào)告；霉菌培養(yǎng)72h，逐日點(diǎn)計(jì)菌落數(shù)，以72h的菌落數(shù)報(bào)告[2][3]。菌回收率的計(jì)算[4]

常規(guī)法測(cè)定醫(yī)院制劑愈喘至圣膏的回收率：用稀釋法測(cè)定愈喘至圣膏的3個(gè)批次回收率見附表1～3。

附表1結(jié)果顯示，供試品對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)有一定抑制作用，回收率為0～45%，均低于70%，故應(yīng)加大培養(yǎng)基稀釋級(jí)進(jìn)行測(cè)定。

附表2結(jié)果顯示，采用培養(yǎng)基稀釋法（0.5ml/皿，1∶400），供試品對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)仍有一定抑制作用，回收率為0～62.5%，均低于70%，故應(yīng)加大培養(yǎng)基稀釋級(jí)進(jìn)行測(cè)定。

附表3結(jié)果顯示，采用培養(yǎng)基稀釋法1∶1000，供試品對(duì)枯草芽孢桿菌回收率仍低于70%，故應(yīng)進(jìn)一步采用薄膜過(guò)濾法測(cè)定，結(jié)果見附表4。

附表4結(jié)果顯示，采用薄膜過(guò)濾法供試品對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)回收率均高于70%，試驗(yàn)細(xì)菌正常生長(zhǎng)。

3 討論

中成藥的微生物檢查是保證藥品質(zhì)量及安全性重要的質(zhì)控指標(biāo)?！吨袊?guó)藥典》2005年版增加了對(duì)藥品進(jìn)行微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)通過(guò)微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)規(guī)定，以確保該品種檢驗(yàn)方法的準(zhǔn)確性，對(duì)提高藥品質(zhì)量有著重要意義 。

現(xiàn)有許多關(guān)于有抑菌作用的中成藥、制劑微生物限度檢查方法驗(yàn)證的試驗(yàn)報(bào)道，但對(duì)滋補(bǔ)中藥制劑的微生物限度檢查方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的情況尚無(wú)報(bào)道。有人認(rèn)為，滋補(bǔ)中藥制劑沒有抑菌活性，無(wú)須進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。筆者通過(guò)對(duì)3個(gè)批次愈喘至圣膏的方法驗(yàn)證研究發(fā)現(xiàn)，該制劑品種對(duì)金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌有一定的抑菌作用，對(duì)白色念珠菌、黑曲霉則無(wú)抑菌作用。

愈喘至圣膏處方中某些藥材炮制后可產(chǎn)生抑菌作用，如黃芪等。根據(jù)方法驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)情況，在沒有確切檢查方法的時(shí)候愈喘至圣膏微生物限度細(xì)菌數(shù)檢查建議采用薄膜過(guò)濾法進(jìn)行測(cè)定較為穩(wěn)妥。

總之，通過(guò)對(duì)3批愈喘至圣膏的驗(yàn)證試驗(yàn)，可得出以下結(jié)論：①愈喘至圣膏的細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果，不僅表明藥典規(guī)定方法學(xué)驗(yàn)證的必要性，而且方法學(xué)驗(yàn)證的數(shù)據(jù)對(duì)評(píng)價(jià)藥品質(zhì)量提供了科學(xué)的依據(jù)；②本品進(jìn)行細(xì)菌、霉菌和酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證時(shí)，預(yù)實(shí)驗(yàn)選用金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌即可快速確定本品的微生物限度檢查方法；③中藥滋補(bǔ)劑不可簡(jiǎn)單作為不做驗(yàn)證試驗(yàn)的依據(jù)。