梅光明 ,陳雪昌 ,張小軍 ,劉 琴 ,李佩佩 ,何依娜 ,郭遠(yuǎn)明
(1.浙江海洋學(xué)院海洋與漁業(yè)研究所,浙江省海洋水產(chǎn)研究所,浙江舟山 316100;2.浙江省海水增養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,浙江舟山 316100)
氯霉素(Chloramphenicol,簡(jiǎn)稱CAP)是一種有效的廣譜抗生素,曾廣泛應(yīng)用于食用動(dòng)物的疾病預(yù)防與防治。甲砜霉素(Thiamphenicol,簡(jiǎn)稱TAP)和氟苯尼考(Forfenicol,簡(jiǎn)稱FFN)為氯霉素的衍生物,抗菌譜和應(yīng)用范圍與氯霉素也基本相同。臨床試驗(yàn)表明食品中殘留的以上3種氯霉素類藥物能使人體產(chǎn)生再生性造血功能障礙以及致命的”灰嬰綜合癥”等毒副作用,其中以氯霉素毒性最強(qiáng)[1-3]。氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的化學(xué)性質(zhì)都極為穩(wěn)定,在曾經(jīng)用藥的食用性動(dòng)物組織中很容易產(chǎn)生藥物殘留。為保障食品安全,目前各國(guó)對(duì)這3種氯霉素類藥物在食品中的殘留限量都做了嚴(yán)格規(guī)定。歐盟(EEC)96/23指令中將CAP列入禁用藥,并且規(guī)定氯霉素MRPL(minimum required performance limits)值為0.30 μg/kg,甲砜霉素MRL(maximum required limits)值為50 μg/kg,氟苯尼考的MRL值為100~2 000 μg/kg。目前水產(chǎn)品中的氯霉素類藥物檢測(cè)方法主要包括酶聯(lián)免疫法[4-5]、液相色譜法[6]、氣相色譜法[7-8]、氣質(zhì)聯(lián)用法[9-10]和液質(zhì)聯(lián)用法[11-13]。酶聯(lián)免疫法易產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果,氣相色譜法和氣質(zhì)聯(lián)用法需化學(xué)衍生化步驟,操作過(guò)程繁瑣復(fù)雜,因而液質(zhì)聯(lián)用法成為氯霉素類藥物殘留量測(cè)定和結(jié)構(gòu)確認(rèn)的最佳方法。本試驗(yàn)采用超高效液相色譜—串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀測(cè)定水產(chǎn)品中的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考,結(jié)合同位素內(nèi)標(biāo)法回收率高、定量定性準(zhǔn)確可靠等特點(diǎn),可以實(shí)現(xiàn)大批量樣品的氯霉素類藥物快速準(zhǔn)確檢測(cè)。
Waters Acquity超高效液相色譜;Premier XE三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀(配電噴霧ESI離子源);SL-502N型臺(tái)式天平;AL204型電子天平;IKA T18基本型組織搗碎機(jī);德國(guó)IKA漩渦振蕩器;Eppendorf 5810臺(tái)式高速離心機(jī);R-201型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀。
甲醇、無(wú)水乙酸銨、乙酸乙酯,均為色譜純。
乙酸銨溶液(5 mmol/L):稱取0.385 g無(wú)水乙酸銨溶解于適量水中后定容至1 000 mL。
氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:稱取適量純度大于98%的氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)品,分別用甲醇溶解并定容,配成100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,-18℃避光保存1年。
混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液:分別準(zhǔn)確吸取1.0 mL氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用甲醇稀釋并定容至100 mL,配成1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,-18℃避光保存6個(gè)月。
混合標(biāo)準(zhǔn)使用液:分別準(zhǔn)確吸取10.0 mL和1.0 mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用甲醇稀釋并定容至100 mL,配成100 ng/mL和10 ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液,-18℃避光保存3個(gè)月。
內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液:準(zhǔn)確吸取100 μL的1.0 mg/mL氘代氯霉素(D5_CAP)標(biāo)準(zhǔn)溶液,用甲醇溶解并定容10 mL,配成1.0 μg/mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,-18℃避光保存6個(gè)月。
內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液:準(zhǔn)確吸取10.0 mL的內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液,用甲醇稀釋并定容至100 mL,配成100 ng/mL,-18℃避光保存3個(gè)月。
1.2.1 液相色譜條件
色譜柱:Acquity UPLC BEH C18柱(2.1 mm×50 mm,1.7 μm);流動(dòng)相:5 mmol/L 乙酸銨溶液(A)+甲醇(B),梯度洗脫條件見(jiàn)表 1;柱溫:40 ℃;進(jìn)樣量:10 μL。
表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programme of mobile phase
1.2.2 三重四級(jí)桿質(zhì)譜條件
離子化模式:電噴霧離子源(ESI),負(fù)離子模式;毛細(xì)管電壓:3.50 kV;離子源溫度:120℃;脫溶劑氣溫度:380 ℃;脫溶劑氣流量:600 L/h;錐孔氣流量:50 L/h;掃描模式:多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM),駐留時(shí)間:0.15 s。反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子、錐孔電壓和碰撞能量見(jiàn)表2。
表2 選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)母離子、子離子和碰撞能量Tab.2 Parent ions,daughter ions and collision energy of MRM
稱取絞碎的魚糜樣品3.0 g于50 mL聚丙烯離心管內(nèi),加入100 μL內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液、15 mL乙酸乙酯和0.45 mL氫氧化銨后渦旋振蕩提取2 min,再加入5.0 g經(jīng)450℃下烘干過(guò)的無(wú)水硫酸鈉,再次渦旋振蕩2 min,6 000 r/min離心5 min,上清液移入100 mL雞心瓶中。殘?jiān)性偌尤?5 mL乙酸乙酯,漩渦振蕩提取2 min,6 000 r/min離心5 min,上清液合并入雞心瓶中。45℃下旋轉(zhuǎn)濃縮至干,加入2 mL的5 mmol/L乙酸銨溶液-甲醇(V/V,90+10)超聲5 min以充分溶解殘?jiān)?,加? mL正己烷渦旋混合30 s,40℃水浴中靜置5 min,6 000 r/min離心5 min分層后棄掉上清液,再加入5 mL正己烷重復(fù)操作1次,最后取1 mL樣液經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾后上機(jī)分析。
氯霉素類藥物屬于弱極性物質(zhì),易溶于有機(jī)溶劑,可用甲醇、乙腈、丙酮和乙酸乙酯等有機(jī)溶劑提取。通過(guò)比較甲醇、乙腈和乙酸乙酯3種溶劑提取效果,結(jié)果表明采用甲醇和乙腈作為提取溶劑的添加回收率較低,3種氯霉素類藥物的添加回收率均在60%以下,而采用乙酸乙酯作為提取溶劑時(shí)添加回收率可達(dá)到70%以上,這與文獻(xiàn)[14-15]報(bào)道的乙酸乙酯對(duì)氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的提取效率最高的結(jié)論一致。PFENNING等[16]發(fā)現(xiàn)提取液中加入少量的氨水對(duì)蝦等水產(chǎn)品具有更高的提取效率。本實(shí)驗(yàn)采用堿化乙酸乙酯提取,濃縮后用正己烷脫脂兩次,可以有效去除水產(chǎn)品中的脂肪等雜質(zhì),上機(jī)分析結(jié)果表明MRM色譜圖基質(zhì)干擾較小,回收率較高,滿足水產(chǎn)品中氯霉素類藥物分析檢測(cè)要求。
本研究采用UPLC快速分離氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考,每個(gè)樣品在3 min以內(nèi)全部出峰,利用流動(dòng)相梯度洗脫程序可以實(shí)現(xiàn)3個(gè)目標(biāo)峰有較好的分離度。另外3種氯霉素類物質(zhì)在電噴霧負(fù)離子模式下(ESI-)的離子響應(yīng)強(qiáng)度比正離子模式下(ESI+)要高,通過(guò)在流動(dòng)相中添加乙酸銨,可以進(jìn)一步增加負(fù)離子模式下的離子響應(yīng)強(qiáng)度,并改善峰型。
在負(fù)離子模式下,用質(zhì)譜蠕動(dòng)泵在20 μL/min的流速下分別注入1.0 μg/mL的氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氘代氯霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液,在母離子掃描(MS Scan)模式下,m/z在 150~750掃描范圍內(nèi)以進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜圖掃描,確定氯霉素、甲砜霉素、氟苯尼考和氘代氯霉素的分子離子,并比較不同錐孔電壓下的母離子強(qiáng)度,確定每個(gè)母離子有最大響應(yīng)值時(shí)的最佳錐孔電壓值。在最佳錐孔電壓下,通過(guò)子離子掃描(Daughter Scan)模式下確定每種氯霉素類藥物的碎片離子,并選擇響應(yīng)強(qiáng)度較高的2個(gè)子離子作為定量離子和定性離子,同時(shí)對(duì)碰撞電壓進(jìn)行優(yōu)化,確定碎片離子有最大響應(yīng)強(qiáng)度時(shí)的最佳碰撞電壓值。優(yōu)化后的參數(shù)見(jiàn)表2。在最佳質(zhì)譜條件和色譜條件下,3種氯霉素類藥物混合標(biāo)準(zhǔn)品的UPLC-MS/MS色譜圖如圖1所示。
由于分析物的共流出組分影響電噴霧接口的離子化效率,因而ESI離子源易受基質(zhì)效應(yīng)的影響,產(chǎn)生離子增強(qiáng)或離子抑制。當(dāng)基質(zhì)效應(yīng)影響大時(shí),會(huì)降低方法的靈敏度,影響方法的準(zhǔn)確性。為最大限度消除基質(zhì)效應(yīng)干擾,本試驗(yàn)采用基質(zhì)匹配法進(jìn)行定量分析。以空白魚糜樣品的提取液為標(biāo)準(zhǔn)溶液的稀釋溶液,可使標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品溶液具有相同的離子化環(huán)境,再結(jié)合采用氘代氯霉素作為內(nèi)標(biāo)物定量,從而較好地消除基質(zhì)效應(yīng)。空白草魚樣品添加標(biāo)準(zhǔn)溶液后測(cè)定圖譜如圖2所示。
圖1 2.00 ng/mL的CAP、TAP和FFN混合標(biāo)準(zhǔn)溶液MRM色譜圖Fig.1 MRM chromatogram of CAP,TAP and FFN mxied standard solution(2.00 ng/mL)
取適量3種混合標(biāo)準(zhǔn)使用液,用空白魚糜樣品提取液(提取時(shí)不加入內(nèi)標(biāo)物)稀釋配置成濃度分別為0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、5.00、10.0、20.0 和 50.0 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,同時(shí)加入內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)使用液,使內(nèi)標(biāo)物濃度均為5.00 ng/mL,進(jìn)樣后以目標(biāo)組分與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值Y對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度X(ng/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)添加標(biāo)準(zhǔn)品配制一定濃度的魚肉樣品,經(jīng)前處理和檢測(cè)后,以S/N=10時(shí)為分析方法的定量檢出限。3種氯霉素類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)和定量檢出限見(jiàn)表3。
以空白草魚和對(duì)蝦為測(cè)試對(duì)象,考察樣品3個(gè)梯度濃度加標(biāo)下測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度和精密度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4,表4結(jié)果表明氯霉素在加標(biāo)量0.10~2.00 μg/kg范圍內(nèi),平均回收率為84.7%~104.9%;甲砜霉素在加標(biāo)量0.50~10.0 μg/kg范圍內(nèi),平均回收率為88.2%~104.1%;氟苯尼考在加標(biāo)量0.50~10.0 μg/kg范圍內(nèi),平均回收率為91.9%~104.1%;且測(cè)定結(jié)果的批內(nèi)相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%,結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確度和精密度完全可以滿足水產(chǎn)品中氯霉素類藥物殘留檢測(cè)的要求。
圖2 草魚空白2.00 μg/kg CAP、TAP和FFN加標(biāo)樣品測(cè)定MRM色譜圖Fig.2 MRM chromatogram of blank grass crap meat spiked with 2.00 μg/kg CAP,TAP and FFN
表3 3種氯霉素類藥物的測(cè)定線性方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和定量檢出限Tab.3 Regression equations,linear range,correlation coefficients,and Quantitation limits of 3 chloramphenicol drugs
結(jié)合本單位承擔(dān)的農(nóng)業(yè)部2012年流通環(huán)節(jié)鮑魚質(zhì)量安全普查任務(wù)工作要求,課題組從北京、杭州和福州等城市的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、批發(fā)市場(chǎng)和超市采集了各品種鮑魚樣品共50份,對(duì)氯霉素、甲砜霉素和氟苯尼考的殘留量進(jìn)行檢測(cè)分析,結(jié)果中2個(gè)樣品檢出含有氟苯尼考,檢測(cè)值分別為14.3 μg/kg和2.01 μg/kg。
本試驗(yàn)建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定水產(chǎn)品中3種氯霉素類藥物殘留量,結(jié)合基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線定量法和同位素內(nèi)標(biāo)法的優(yōu)點(diǎn),較好地消除了基質(zhì)效應(yīng),方法前處理過(guò)程簡(jiǎn)便快捷,檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高、精密度好,在大批量實(shí)際樣品的檢測(cè)中取得了滿意的結(jié)果。
表4 空白樣品中添加CAP、TAP和FFN的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Tab.4 Recoveries and relative standard deviations of CAP,TAP and FFN in spiked samples(n=6)
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