王家勝，羅建紅，張筱敏 綜述

(浙江大學醫(yī)學院神經(jīng)科學研究所，浙江杭州 310058)

蛋白質從內質網(wǎng)到高爾基體的運輸過程，也稱為早期分泌途徑(early secretary pathway)，是對蛋白質進行質量控制和分選的重要階段。蛋白質在內質網(wǎng)經(jīng)過初步加工后，在內質網(wǎng)輸出 位 點 (Endoplasmic Reticulum exit sites，ERES)與外被蛋白復合體Ⅱ(coat protein complexⅡ，COPⅡ)形成囊泡，與內質網(wǎng)分離。囊泡隨即脫掉COPⅡ并與內質網(wǎng)-高爾基體中間 體(ER-Golgi intermediate compartment，ERGIC)融合。蛋白在ERGIC內進一步成熟，并形成管狀的囊泡［1］離開ERGIC，由動力蛋白沿微管運往高爾基體。

受體接受細胞內外的刺激后經(jīng)信號分子傳導引發(fā)細胞特定的響應，而蛋白質磷酸化在信號傳導過程中起重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，內質網(wǎng)到高爾基體的運輸過程也是受信號分子磷酸化調控的。這種調控使得蛋白轉運速率可以因細胞內外環(huán)境變化而調整，對細胞生長、存活、維持穩(wěn)態(tài)有重要意義［2］。作者針對蛋白質從內質網(wǎng)到高爾基體的運輸過程(著重于內質網(wǎng)、ERGIC、高爾基體之間)的信號分子調控機制作一綜述。

1 內質網(wǎng)上信號分子對蛋白質分泌的調控

蛋白質在內質網(wǎng)內經(jīng)過初步折疊、修飾后，在ERES形成COPⅡ囊泡。COPⅡ不僅能招募和聚集待運輸?shù)牡鞍踪|，還促進了囊泡的出芽過程［3］。雖然有證據(jù)顯示，包含載脂蛋白的乳糜微粒囊泡出芽并不依賴于COPⅡ［4］，但絕大多數(shù)蛋白質囊泡的出芽是依賴 COPⅡ的［5］。小GTP酶Sar1和兩種異源二聚體復合物Sec23-Sec24、Sec13-Sec31共同組成COPⅡ囊泡的外被。在COPⅡ囊泡形成時，首先由鳥苷酸交換因子Sec12招募Sar1-GDP，并將其轉化為Sar1-GTP，Sar1-GTP作為“開關分子”引發(fā)外被形成過程。接著，Sec23-Sec24與可溶性蛋白受體或跨膜蛋白結合發(fā)揮貨物蛋白質(cargo protein)揀選功能。最后，Sec13-Sec31在Sec23-Sec24外周形成一層易彎曲的“籠子”，以適應不同大小的轉運蛋白質。近年來，研究發(fā)現(xiàn)多條信號通路和多種信號分子能作用于ERES，從而調控蛋白質運輸囊泡的出芽過程。

1.1 MAPK信號通路 通過小干擾 RNA(siRNA)篩選Hela細胞的916種激酶和磷酸酶，確定了其中122種激酶和磷酸酶與囊泡從內質網(wǎng)到高爾基的運輸有關［6］。其中包含了MAPK信號通路中的各種激酶，其作用位點在內質網(wǎng);激活MAPK信號通路能引起ERES數(shù)目增加，并且MAPK蛋白Erk2能直接磷酸化Sec16第415位蘇氨酸。Sec16是一種分子量為240-280 kDa的膜周邊蛋白，是ERES產(chǎn)生和維持的關鍵分子，生理狀態(tài)下定位在ERES。研究發(fā)現(xiàn)，Sec16能與COPⅡ組成蛋白(Sec13-Sec31，Sec23-Sec24)相互作用，并招募 COPⅡ組成蛋白在 ERES聚集促進囊泡形成［7］。Sec16還以通過尚不明確的機制招募Sar1促進囊泡形成［8］。因此，MAPK通路激活導致Sec16激活可以促進COPⅡ形成。

1.2 PCTAIRE激酶與 Sec23A PCTAIRE是一種周期蛋白依賴激酶，主要存在于分化終末的細胞中。PCTAIRE亞型PCTAIRE-1能被周期蛋白Y(Cyclin Y)激活，并參與神經(jīng)元軸突囊泡轉運［9］。PCTAIRE也被發(fā)現(xiàn)在微管相關蛋白tau的磷酸化中起作用，但不依賴于周期蛋白激活［10］。酵母雙雜交實驗發(fā)現(xiàn)，磷酸化的PCTAIRE-1和3可以與磷酸化的Sec23A相互作用，并且PCTAIRE的激酶活性對COPⅡ的出芽是必需的［11］。雖然PCTAIRE并不直接磷酸化Sec23A和其他COPⅡ蛋白，但可能通過磷酸化與COPⅡ出芽相關的分子如動力蛋白(Dynein)和動力蛋白激活蛋白(Dynactin)發(fā)揮調控作用［12］。已經(jīng)有研究表明，PKA 對PCTAIRE-1的磷酸化能減弱PCTAIRE-1的激酶活性，影響神經(jīng)母細胞瘤突起生長［13］;而周期蛋白依賴激酶5(CDK5)對PCTAIRE-1的磷酸化則能增強其激酶活性，并促進神經(jīng)元樹突發(fā)育［14］。但上述PCTAIRE激酶活性的調控對COPⅡ出芽的影響還有待進一步研究證明。

1.3 Ca2+依賴的ALG-2調控 凋亡相關基因2蛋白(Apoptosis-linked gene 2 protein，ALG-2)有5個依次相連的EF-hand結構域與鈣離子結合，是一種細胞內鈣離子濃度的感受器。研究表明，生理狀態(tài)下ALG-2存在于ERES附近，在鈣刺激下會引起ALG-2成簇狀分布，鈣的螯合劑則會導致 ALG-2與 ERES共定位消失［15］。近年研究發(fā)現(xiàn)，ALG-2與 COPⅡ組成蛋白Sec31A有鈣離子依賴的相互作用，并成簇狀共定位分布，無論是降低ALG-2的表達量還是降低胞鈣濃度，都會減少Sec31A在ERES的量，同時簇狀分布消失［16，17］。熒光漂白恢復實驗發(fā)現(xiàn)，Sec31A同ALG-2結合位點的突變將降低Sec31A與ERES結合的高親和性，提示ALG-2與Sec31A的結合對Sec31A在ERES發(fā)揮作用有重要關系［18］。還有研究顯示，在體外鈣離子作用下ALG-2通過穩(wěn)定COPⅡ囊泡結構抑制COPⅡ的相互融合［19］，但體內 ALG-2對 COPⅡ囊泡的調控還知之甚少。雖然上述研究表明ALG-2能通過對不同胞內鈣濃度的響應來調控Sec31A的量和分布，但鈣信號介導的ALG-2對COPⅡ囊泡具體調控機制有待進一步研究。

1.4 脂質信號(lipid signaling) 類二十烷酸、磷酸肌醇、磷酸酰肌醇、鞘磷脂、脂肪酸等脂質作為信號分子，在調控細胞增殖分化、凋亡、新陳代謝、遷移等過程中發(fā)揮重要作用［20］。細胞外信號能控制一系列脂質酶的活性，這些酶通過對脂質特異地修飾使脂質發(fā)揮信號分子的作用。

磷酸酰肌醇(Phosphatidylinositol，PtdIns)的3個羥基被選擇性磷酸化得到的衍生物能作為不同膜性細胞器的標志，在調控蛋白運輸中起重要作用。PtdIns第4號位羥基被磷酸化得到的PtdIns(4)P主要存在于高爾基體及ERES上。PtdIns(4)P可由內質網(wǎng)上大量分布的PtdIns經(jīng)PI4K磷酸化產(chǎn)生［21］。研究發(fā)現(xiàn)，Sar1在ERES上被募集和激活能使PtdIns(4)P含量上升，而PtdIns(4)P能促進COPⅡ囊泡的形成［22］。因為PI4K亞型PI4KⅡ能在體外條件下被Sar1激活，且分布在內質網(wǎng)周圍，因此Sar1可能通過PI4KⅡ調控PtdIns(4)P含量。此外，PI4K另一亞型PI4KⅢ在未折疊蛋白反應(Unfolded protein response，UPR)激活時含量增加，并促進囊泡形成，也可能通過PtdIns(4)P途徑調控這個過程［23］。磷脂酰膽堿也有相似的調控過程。Sar1的磷酸化能激活磷酸酶D(Phospholipase D，PLD)，加快PLD將磷脂酰膽堿水解為膽堿和磷脂酸，后者進一步促進Sec23/Sec24 聚集，加快囊泡形成［24］。

2 ERGIC上信號分子調控

內質網(wǎng)-高爾基體中間體(ERGIC)，也被稱為管泡樣囊泡聚集體(Vesiculo-tubular clusters)或前高爾基中間體(pre-Golgi intermediates)，是與ERES在空間上并列且位置相對固定的膜性結構［25］，發(fā)揮聚集蛋白質、促進蛋白質折疊和質量控制等作用。

人們對ERGIC上信號分子調控分泌途徑的機制知之甚少，目前僅發(fā)現(xiàn)包含PKC激酶家族的信號通路能對該過程進行調控。根據(jù)PKC的激活方式可以將PKC家族分為經(jīng)典PKC 激 酶 (classical or conventional PKCs，cPKCs)、新型 PKC 激酶(novel PKCs，nPKCs)和非典型 PKC激酶(atypical PKCs，aPKCs)三類［26］。研究發(fā)現(xiàn)，Src激酶能磷酸化 aPKC激酶的 PKCλ 和 PKCι，促進 PKCλ 和 PKCι定位到ERGIC膜上，使PKCλ和PKCι發(fā)揮磷酸化甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)的激酶活性［27］。有證據(jù)顯示，磷酸化的GAPDH在內質網(wǎng)到高爾基體的分泌途徑中可能通過招募動力蛋白與微管結合并促進囊泡從ERGIC出芽而發(fā)揮調控作用［28］。此外，新型PKC激酶PKCδ和PKCε也被發(fā)現(xiàn)作用于ERGIC并能調控ERGIC形態(tài)，但PKCδ和PKCε似乎并不影響蛋白在內質網(wǎng)和高爾基體間的正向或逆向轉運［29］。

3 高爾基體上信號分子調控

蛋白從內質網(wǎng)到高爾基體的運輸不僅受胞外刺激引發(fā)的信號通路調控，還受到運輸過程引發(fā)的反饋信號調節(jié)。近年來一系列研究發(fā)現(xiàn)，包含在囊泡內的內質網(wǎng)駐留蛋白能間接激活高爾基體上信號通路產(chǎn)生反饋調節(jié)機制，維持高爾基體的穩(wěn)態(tài)。

酪氨酸激酶Src被發(fā)現(xiàn)廣泛存在于高爾基體周圍，調控高爾基體的形態(tài)，并且磷酸化的Src對保持高爾基體結構的完整是不可或缺的［30］。Src的缺失不會影響蛋白從內質網(wǎng)到高爾基體的順向轉運速率，但會降低蛋白從高爾基體到內質網(wǎng)的逆向轉運速率［31］。研究發(fā)現(xiàn)，貨物蛋白從內質網(wǎng)到高爾基體的運輸促進Src的激活，引發(fā)Src磷酸化高爾基體上一系列底物。酵母雙雜交實驗表明Src與KDEL受體具有相互作用，這種相互作用還可直接介導Src的激活［32］。KDEL受體能特異地識別可溶性內質網(wǎng)駐留蛋白N端的KDEL氨基酸序列，位于ERGIC或高爾基體的KREL受體負責將可溶性內質網(wǎng)駐留蛋白逆向轉運回內質網(wǎng)。當可溶性內質網(wǎng)駐留蛋白運達高爾基體，駐留蛋白與KDEL受體結合引發(fā)該受體的二聚化而激活，激活后的KDEL受體招募形成負責逆向轉運的COPⅠ囊泡，將可溶性內質網(wǎng)駐留蛋白逆向轉運回內質網(wǎng)。Src能磷酸化KDEL受體，并且KDEL受體第209位絲氨酸磷酸化可以促進其在高爾基體上與COPⅠ囊泡蛋白結合［33］，提示KDEL受體介導的Src激活能反饋作用于KDEL受體，促進可溶性內質網(wǎng)駐留蛋白的逆向轉運。Src不僅影響貨物蛋白從高爾基體到內質網(wǎng)的逆向轉運，Src的激活還能促進貨物蛋白在高爾基體內的轉運［32］。因此，這種通過KDEL受體感知貨物運輸“壓力”并通過激活Src促進貨物蛋白在高爾基體內轉運和逆向轉運的過程，實現(xiàn)了高爾基體貨物輸入和輸出的平衡，有助于維持高爾基體結構的穩(wěn)定［34］。

4 結論與展望

過去10年對囊泡轉運機制及轉運調控機制的研究，極大增進了人們對細胞內膜系統(tǒng)的了解。盡管現(xiàn)有的研究遠不能讓人們了解囊泡轉運與調控機制的每個細節(jié)，但更多更細致的工作將最終會驅散籠罩于囊泡轉運和調控機制的迷霧。

信號分子調控作為調控機制的重要一種，在5年的研究中，發(fā)現(xiàn)其在囊泡從內質網(wǎng)經(jīng)ERGIC到高爾基體的運輸中發(fā)揮重要作用。雖然對信號分子調控機制的研究才剛剛起步，但一些令人信服的結果表明，信號分子能作用于運輸涉及的三個膜性結構——內質網(wǎng)、ERGIC和高爾基體，調控囊泡的出芽和融合。蛋白從內質網(wǎng)到高爾基體的運輸不僅受胞外刺激引發(fā)的信號通路調控，還受到囊泡內轉運物質的反饋調節(jié)。如囊泡內的內質網(wǎng)駐留蛋白能引起高爾基體上Src通路的激活，該過程對維持高爾基體的穩(wěn)態(tài)有重要意義。

由于各種信號通路間存在交叉(crosstalk)，極大增加了通路研究的復雜性。應用系統(tǒng)生物學原理進行高通量篩選是發(fā)現(xiàn)信號調節(jié)通路的趨勢。已有研究通過siRNA方法發(fā)現(xiàn)，從質膜受體到靶細胞器調控膜轉運的完整通路［6］，該MAPK通路作用于 ERES上的Sec16，通路的激活促進囊泡出芽。以往的研究常常采用水泡性口炎病毒G蛋白(vesicular stomatitis virus G protein，VSV-G)來研究信號分子對囊泡運輸?shù)恼{控，但是生理情況下信號分子的調控應該是轉運蛋白特異性的。如研究發(fā)現(xiàn)蛋白激酶PKA和PKC能磷酸化N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體的NR1亞基，促進包含NR1亞基的 NMDA受體從 ERES排出［35］，這也正展示了一個特異性蛋白質膜轉運調控的模式。對信號分子特異性調控蛋白轉運的研究將極大發(fā)展人們對信號調控機制的理解，為治療因從內質網(wǎng)到高爾基體蛋白質轉運異常引發(fā)的疾病如遲發(fā)性脊椎骨骺發(fā)育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda，SEDT)、合并凝血因子V和凝血因子 VIII缺乏癥(combined factor V and factor VIII deficiency)等提供新的線索［36-38］。

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