曹 鵬，牟 妍，高 飛，耿金培，張禧慶，隋 濤，梁君妮，沙美蘭，關(guān)麗麗

（1.煙臺出入境檢驗檢疫局，山東 煙臺 264000；2.青島出入境檢驗檢疫局，山東 青島 266000；3.煙臺杰科檢測服務(wù)有限公司，山東 萊陽 265231）

喹諾酮類藥物（quinolones，QNs）是一類合成抗生素，具有抗菌譜廣、活性高、無交叉耐藥性、耐藥突變概率低、口服吸收好、半衰期長、價格便宜、不良反應(yīng)少等優(yōu)點，被世界各國廣泛應(yīng)用于畜禽和水生動物疾病的防治［1］。若長期食用殘留量高或被此類藥物污染的食品，會在人體內(nèi)積累，同時會使致病菌產(chǎn)生耐藥性，從而危害人類健康［2］。目前市場上出現(xiàn)了非法使用該類藥物的情況，比如餐飲行業(yè)中的火鍋和麻辣燙，有部分商家在火鍋和麻辣燙里添加喹諾酮類藥物（防止人食用該類食物后細(xì)菌中毒，引起腸胃不適等）。在我國衛(wèi)生部公布的食品中違法添加的物質(zhì)名單中即有此類藥物［3］。為了保障人民飲食安全，有必要建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的方法對火鍋和麻辣燙食材中的喹諾酮類藥物進行檢測，進而可以有效地監(jiān)督管理。

目前用于喹諾酮類藥物殘留的檢測方法有微生物法［4-6］、高效液相色譜法［7-9］、高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法［10-15］、酶聯(lián)免疫分析法［16-18］、毛細(xì)管區(qū)帶電泳法［19］等，基質(zhì)主要是畜禽、水產(chǎn)品的肌肉、內(nèi)臟等組織及副產(chǎn)品［4-19］，對火鍋食材、火鍋底料等成分復(fù)雜、油性大的基質(zhì)檢測還沒有相關(guān)報道。

QuEChERS法是由Anastassiades等［20］開發(fā)的一種快速（quick）、簡單（easy）、廉價（cheap）、高效（effective）、耐用（rugged）、安全（safe）的分散固相萃取方法，由于該方法有簡單易行、穩(wěn)定可靠的優(yōu)點，現(xiàn)已被用于農(nóng)藥殘留［21，22］和獸藥殘留［23-26］的檢測?，F(xiàn)在常用的普通液液萃取和固相萃取柱的方法存在提取不完全、基質(zhì)干擾大等問題，不適用于各種火鍋食材樣品中喹諾酮類藥物的檢測。針對上述問題，本文將QuEChERS法和超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜有機結(jié)合起來，對提取凈化方法、色譜-質(zhì)譜條件進行了改進和優(yōu)化，建立了一種分散固相萃取凈化結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜同時檢測火鍋食材中11種喹諾酮類藥物的方法。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290UPLC-6490A超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）；漩渦 混 合 器 VOATEX-2（Scientific Industries）；SB5200型超聲波清洗機（美國Branson公司）；CF16RXⅡ型高速冷凍離心機（日本Hitachi公司）；Milli-Q超純水（美國 Millipore公司）；氮吹濃縮儀（美國Organomation Associates公司）。

恩諾沙星（enrofloxacin）、環(huán)丙沙星（ciprofloxacin）、諾氟沙星（norfloxacin）、氧氟沙星（ofloxacin）、達氟沙星（danofloxacin）、沙拉沙星（sarafloxacin）、洛美沙星（lomefloxacin）、培氟沙星（pefloxacin）、二氟沙星（difloxacin）、奧比沙星（orbifloxacin）、馬波沙星（marbofloxacin）均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司（純度＞99.0%）。乙腈、甲醇、甲酸為色譜純，氯化鈉、醋酸鈉、乙酸銨、硫酸鎂均為分析純；N-丙基乙二胺吸附劑（PSA，Agilent公司），十八烷基鍵合硅膠吸附劑（C18，Agilent公司），石墨化炭黑（GCB，Agela公司）；微孔濾膜（0.22μm）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取11種喹諾酮類藥物標(biāo)準(zhǔn)品，折合成目標(biāo)化合物20mg（精確至0.1mg）置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，混勻配制成200mg／L的單標(biāo)儲備液；分別準(zhǔn)確移取1mL各單標(biāo)儲備液置于100mL棕色容量瓶中，用乙腈定容至刻度，配成2mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)中間液；根據(jù)需要移取適量混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用乙腈-水（含0.1%甲酸）（1∶1，v／v）稀釋成適用濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。各種標(biāo)準(zhǔn)溶液密封保存于4℃冰箱中。

1.3 樣品前處理

將樣品用食品加工機充分?jǐn)嚢?、均質(zhì)，分出0.5 kg作為試樣，置于清潔的樣品容器中，密封，并做好標(biāo)記。將制備好的試樣于0～4℃下冷藏保存。

1.3.1 樣品提取

菜類:稱取15.0g樣品至50mL離心管中，加15mL含5%甲酸的正己烷飽和的乙腈、3.0g醋酸鈉和3.0g氯化鈉，劇烈振蕩，超聲提取15min，于6000r／min下離心5min，吸取上清液10mL于10 mL離心管中，提取液待凈化。

調(diào)味料、肉制品、脫水制品等:稱取5.0g樣品至50mL離心管中，加入10mL水劇烈振蕩搖勻，浸泡15min，然后加入15mL含5%甲酸的正己烷飽和的乙腈、3.0g醋酸鈉和3.0g氯化鈉，劇烈振蕩，超聲提取15min，于6000r／min下離心5min，吸取上清液10mL于50mL離心管中，提取液待凈化。

1.3.2 樣品凈化

提取液中依次加入500mg C18、200mg PSA、1.0g無水硫酸鎂，輕微振蕩1min，于5000r／min下離心5min，分取上層凈化液2.0mL，氮氣吹干，加入2.0mL乙腈-水（含0.1%甲酸）（1∶1，v／v）溶解并定容（若有油脂可再加入0.8mL乙腈飽和的正己烷去除），過0.22μm微孔濾膜，濾液供液相色譜-質(zhì)譜測定。

1.4 色譜和質(zhì)譜條件

色譜柱:Poroshell 120EC-C18柱（100mm×3.0mm，2.7μm）；柱溫:35 ℃；進樣量:5μL；流速:0.25mL／min。流動相:A 為5mmol乙酸銨-0.1%甲酸水，B為甲醇。梯度洗脫程序:0～2.0 min，90%A；2.0～6.0min，90%A～10%A；6.0～7.0min，10%A～90%A；7.0～8.0min，90%A。

本次在整個灌漿處理措施前未進行鉆孔彈模測試，僅在復(fù)合灌漿前和灌漿后分別進行了3個孔和5個孔共50多點的測試。鑒于該水道系統(tǒng)的最大作用水頭，最大工程壓力取6 MPa，變形模量計算取2 MPa～6 MPa壓力對應(yīng)的模量。

離子源:電噴霧電離，正離子模式（ESI＋）；毛細(xì)管電壓:3.0kV；離子源溫度:120℃；脫溶劑氣:N2；脫溶劑氣溫度:350℃；脫溶劑氣流速:750L／h；碰撞氣:高純Ar；掃描方式:多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）。11種喹諾酮類藥物的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。

表1 11種喹諾酮類藥物的多反應(yīng)監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)Table 1 MS parameters in MRM mode for the 11 QNs

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 提取條件的選擇

喹諾酮類化合物的分子結(jié)構(gòu)中含有羧基和叔胺基，具有酸堿兩性性質(zhì)，易溶于酸性或堿性溶液。文獻報道的提取方法大多用純有機溶劑（乙腈、甲醇、二氯甲烷等），而在有機溶劑中添加一定比例的酸或堿等提取可顯著提高回收率［24，25］。本文首先考察了QuEChERS法常用提取溶劑（乙腈、乙酸乙酯）的提取效果。試驗發(fā)現(xiàn)，乙腈與乙酸乙酯的提取回收率相當(dāng)；但用乙酸乙酯提取的溶劑顏色較深，表明其帶出了弱極性基質(zhì)成分，這將增加后續(xù)凈化的難度；乙腈在有效提取目標(biāo)物的同時具有沉淀蛋白質(zhì)的作用，且其帶出的弱極性成分少，反映在質(zhì)譜上響應(yīng)高、基質(zhì)影響小，因而選用乙腈作提取溶劑。

本文在已有研究［23-26］的基礎(chǔ)上，進一步采用含5%甲酸的正己烷飽和的乙腈溶液作為提取溶劑進行提取試驗。正己烷飽和的乙腈在提取過程中能更好地起到浸潤的作用，降低了提取溶液及含水基質(zhì)提取液中的水分，從而減輕了后續(xù)的除水壓力。結(jié)果表明，該提取試劑不僅去除脂肪和蛋白質(zhì)的效果好，而且容易濃縮，提取回收率也可滿足要求。

另外，在提取時，比較了直接乙腈提取與先加水分散再用乙腈提取的處理方法，結(jié)果（見圖1）表明，先加水將樣品充分分散后再用乙腈提取可獲得更高的回收率，這可能與乙腈具有的蛋白質(zhì)凝結(jié)作用有關(guān)，凝結(jié)的蛋白質(zhì)阻礙了其進入內(nèi)部發(fā)生作用，所以選擇先加水分散再用乙腈提取的處理方法。

圖1 不同提取方法對11種藥物回收率的影響Fig.1 Effects of different extraction methods on the recoveries of the 11 compounds

2.1.2 凈化條件優(yōu)化

分散固相萃取是QuEChERS方法的凈化手段，PSA、C18、GCB是常用的吸附劑。采用PSA分散性固相萃取凈化，可有效去除乙腈提取液中脂肪酸、糖類、酚類以及極性色素等成分；C18具有良好的除脂能力；GCB可去除提取液中的色素成分，但對含苯環(huán)官能團的化合物有較強的吸附作用。禽肉中含有豐富的蛋白質(zhì)（用乙腈提取時已被沉淀）及脂肪類物質(zhì)，而目標(biāo)物幾乎都含有苯環(huán)，故本研究只選取PSA、C18作為凈化吸附劑進行優(yōu)化。

圖2 不同凈化條件對11種藥物回收率的影響Fig.2 Effects of different purification conditions on the recoveries of the 11 compounds

將最終凈化液在氮氣下緩緩吹干，某些復(fù)雜基質(zhì)會有少許黃色液滴，可在定容后加入0.8mL乙腈飽和的正己烷，振蕩離心后去除，過微孔濾膜后溶液即澄清。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

為維持流動相的低pH值以抑制硅醇基的解離和保證喹諾酮類化合物在流動相中的穩(wěn)定溶解狀態(tài)。本文采用0.1%甲酸或乙酸來控制流動相的pH值，試驗發(fā)現(xiàn)二者均可得到對稱、尖銳的峰形，但甲酸更利于喹諾酮類化合物的離子化，可得到較高的檢測靈敏度，故本實驗中選擇用0.1%甲酸控制流動相的pH值，可以提高靈敏度，并且加入微量的NH＋4可使峰形更尖銳、響應(yīng)更穩(wěn)定。最終本實驗選擇5mmol乙酸銨-0.1%甲酸水作為流動相A。

實驗還對定容溶液進行了選擇，發(fā)現(xiàn)采用不同的溶劑作為標(biāo)準(zhǔn)稀釋液或樣品處理后的復(fù)溶溶液會對質(zhì)譜響應(yīng)及色譜峰形產(chǎn)生顯著影響。比例過高的有機溶劑能明顯增強質(zhì)譜響應(yīng)，但同時也會造成部分化合物的色譜峰形坍塌，比例過低的有機溶劑不能完全溶解目標(biāo)物。經(jīng)多次試驗，確定以乙腈-水（含0.1%甲酸）（1∶1，v／v）溶液作為定容溶液，可獲得對稱、尖銳的峰形和良好的質(zhì)譜響應(yīng)。

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

喹諾酮類化合物因含有羰基等多電子基團而適合在ESI源的正離子模式下形成［M＋H］＋準(zhǔn)分子離子，以此作為母離子。在ESI模式下分別對1.0 mg／L的11種QNs的單標(biāo)準(zhǔn)溶液進行全掃描得到準(zhǔn)分子離子峰，再通過優(yōu)化碰撞能量等參數(shù)得到11種藥物的子離子。11種藥物的定量和定性子離子及相應(yīng)的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的消除

盡管樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白質(zhì)、分散固相萃取后得到了良好的凈化，但仍無法完全消除基質(zhì)效應(yīng)。本文在建立方法過程中，發(fā)現(xiàn)大部分QNs均存在不同程度的基質(zhì)效應(yīng)，且均為抑制效應(yīng)。綜合考慮，本方法采用蔬菜類、肉類及火鍋底料類3種空白樣品配制基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液，很好地消除了基質(zhì)影響（見表2），完全能滿足喹諾酮類藥物殘留檢測的要求。

2.5 方法的線性范圍和檢出限

采用基質(zhì)加標(biāo)工作曲線進行外標(biāo)法定量。根據(jù)基質(zhì)的不同，按上述方法進行提取、凈化和濃縮，采用不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液進行定容、檢測，得到基質(zhì)加標(biāo)工作曲線。實驗表明，在1.0～100.0μg／L范圍內(nèi)，11種喹諾酮類藥物的線性方程相關(guān)系數(shù)均大于0.998。分別根據(jù)3倍和10倍信噪比確定化合物的檢出限（LOD）和定量限（LOQ）。11種喹諾酮類藥物的線性方程、相關(guān)系數(shù)、LOD和LOQ見表3。

表2 基質(zhì)效應(yīng)消除前后11種藥物的回收率Table 2 Recoveries of the 11 compounds before and after matrix effect elimination

表3 11種喹諾酮類藥物的線性關(guān)系、檢出限及定量限Table 3 Linear relationships，LODs and LOQs of the 11 QNs

2.6 方法的回收率和精密度

在不同的火鍋食材樣品中添加喹諾酮類標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別添加3個不同濃度水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個水平重復(fù)測定6次，采用外標(biāo)法進行定量，計算回收率和精密度（以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差表示）。圖3為火鍋底料中11種QNs類藥物的MRM譜圖。結(jié)果表明，本方法11種藥物的回收率范圍為70.1%～100.3%，RSD都小于11%（見表4），表明本方法有良好的準(zhǔn)確度和精密度，滿足喹諾酮類藥物痕量分析的要求。

圖3 火鍋底料中11種喹諾酮類藥物的MRM譜圖（添加水平為10μg／kg）Fig.3 MRM Chromatograms of the 11 QNs in hotpot seasoning spiked at 10μg／kg

表4 不同食品中11種喹諾酮類藥物的回收率和精密度（n＝6）Table 4 Recoveries and relative standard deviations（RSDs）of the 11 QNs spiked in different foods（n＝6）

2.7 實際樣品測定

為驗證該方法的可靠性，從超市購買了18種火鍋底料、蔬菜、豆腐、蘑菇、禽肉制品進行測定，同時作質(zhì)控樣品。樣品均未檢出QNs藥物殘留，質(zhì)控樣品的回收率等指標(biāo)均達到分析要求，表明結(jié)果準(zhǔn)確、可靠。下一步準(zhǔn)備擴大取樣，準(zhǔn)備從火鍋店抽取樣品進行檢測。

3 結(jié)論

本文建立了同時檢測火鍋食材中11種喹諾酮類藥物殘留的分散固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。采用酸化乙腈溶液提取后進行分散固相萃取凈化，有效提高了提取率，減少了雜質(zhì)的干擾，快速、簡潔。在優(yōu)化了提取和凈化方法的同時，采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法很好地消除了基質(zhì)影響，提高了檢測靈敏度。該方法作為火鍋食材中11種喹諾酮類藥物殘留的確證方法，具有簡便、靈敏、準(zhǔn)確的優(yōu)點，可以更有效地監(jiān)控市場違法添加喹諾酮類藥物的行為，保證人民食品安全。

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