張倩倩， 康經(jīng)武

(中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所，上海 200032）

低分子量肝素(LMWHs）是一類抗凝血藥物，廣泛用于血栓栓塞性疾病的預(yù)防及治療［1］。其抗凝作用是通過(guò)與血液中的抗凝血酶Ⅲ(ATⅢ）發(fā)生相互作用完成的。高負(fù)電荷密度的肝素能與ATⅢ上帶正電的賴氨酸結(jié)合，使ATⅢ的分子結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，暴露出活性部位的精氨酸，從而大大增加了ATⅢ與凝血因子中絲氨酸接觸的概率，可使其抗凝血活性增強(qiáng)1000倍左右［2］。與普通肝素相比，LMWHs增強(qiáng)了對(duì)凝血因子Xa(FXa）活性的抑制，但降低了對(duì)凝血酶活性的抑制，同時(shí)減少了它與內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及其他非特異性血漿蛋白的結(jié)合，因而具有出血副作用小、生物利用率高、皮下注射吸收好、半衰期長(zhǎng)等優(yōu)點(diǎn)［1，2］。

經(jīng)典的肝素活性的檢測(cè)方法是凝血實(shí)驗(yàn)，如活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT）和活化凝血時(shí)間(activated clotting time，ACT）［3－5］。這些方法易受實(shí)驗(yàn)室、試劑、儀器設(shè)備等條件變化的影響，并且靈敏度低，通常只能得到半定量的結(jié)果［3］。由于LMWHs能夠非常顯著地抑制FXa的活性，因此，測(cè)定LMWHs對(duì)FXa活性的抑制作用被認(rèn)為是檢測(cè)LMWHs活性的黃金標(biāo)準(zhǔn)［6］。目前，最廣泛使用的測(cè)定肝素抗FXa活性的方法是底物生色法［7］。其測(cè)試原理為:LMWH與過(guò)量的ATⅢ、FXa混合，形成三元復(fù)合物L(fēng)WMH·ATⅢ·FXa;形成復(fù)合物的FXa不再具有凝血活性，而剩余的未形成復(fù)合物的FXa仍能夠水解其標(biāo)記有發(fā)色團(tuán)(常用發(fā)色團(tuán)為對(duì)硝基苯胺，pNA）的肽底物，釋放出可以被光度計(jì)定量測(cè)定的對(duì)硝基苯胺［8］。在405 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)到的吸光度值與樣品中LWMH的活性成反比，這樣就可以間接獲得LMWHs的活性。盡管測(cè)定抗FXa活性的分光光度測(cè)試比傳統(tǒng)的凝血測(cè)試具有更高的檢測(cè)靈敏度和準(zhǔn)確度，但仍然存在一些缺點(diǎn):分光光度法要求樣品足夠清澈透明，而ATⅢ和FXa都有紫外吸收，復(fù)雜樣品如血漿還有一定的濁度，因而在測(cè)定LMWHs活性時(shí)會(huì)引起一定的誤差;此外，分光光度法所需要的樣品量較大，尤其是ATⅢ和FXa，這些試劑價(jià)格昂貴，使得測(cè)試成本較高［9］。最近 Harris 等［9－11］發(fā)展了基于熒光分析的抗FXa測(cè)試方法，雖然可以避開樣品背景吸收的干擾，但熒光底物的背景熒光對(duì)檢測(cè)仍有較明顯的干擾。

體積排阻色譜(SEC）采用化學(xué)惰性的多孔物質(zhì)為固定相，按樣品中各個(gè)組分相對(duì)分子質(zhì)量大小實(shí)現(xiàn)分離。另外，熵驅(qū)動(dòng)的SEC分離機(jī)制，最大限度地降低了分析物與固定相間的直接作用，大大簡(jiǎn)化了分離條件，僅使用溫和的流動(dòng)相和簡(jiǎn)單的洗脫條件就可以實(shí)現(xiàn)分離［12］。目前SEC已被廣泛應(yīng)用于大分子甚至是血漿蛋白的分離［12］。采用SEC色譜分離的方法排除復(fù)雜樣品基質(zhì)的干擾，就可以實(shí)現(xiàn)更準(zhǔn)確的測(cè)量。

依諾肝素是當(dāng)前使用最廣泛的一種LMWH。用本文發(fā)展的基于體積排阻色譜的方法對(duì)依諾肝素抗FXa的活性進(jìn)行了測(cè)試。方法以液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器作為微量的酶反應(yīng)器，依諾肝素、ATⅢ、FXa和生色底物的溶液依次進(jìn)樣，在進(jìn)樣器中混合、孵育，反應(yīng)一段時(shí)間后，注入體積排阻色譜中進(jìn)行分離檢測(cè)。自動(dòng)進(jìn)樣器大大減少了樣品的消耗量。將酶反應(yīng)產(chǎn)生的pNA與樣品中的其他物質(zhì)分離后在其最大吸收波長(zhǎng)(385 nm）下測(cè)定，提高了測(cè)試的靈敏度。通過(guò)方法的驗(yàn)證，證明了該方法具有較好的準(zhǔn)確性和精密度。這種基于體積排阻色譜-液相色譜的方法還可以用于血漿中依諾肝素抗FXa活性的監(jiān)測(cè)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀，配置有二元泵、紫外檢測(cè)器、柱溫箱和高性能自動(dòng)進(jìn)樣器;TSKgel MP(PW）-M預(yù)柱(35 mm×4.6 mm）。

ATⅢ(25 IU/支）和 FXa(71 nkat/支）購(gòu)自意大利Chromogenix公司。FXa發(fā)色肽底物(chromogenic peptide substrate，CPS，序列:CH3OCO-DCHA-Gly-Arg-pNA·AcOH）、對(duì)硝基苯胺、人混合血漿購(gòu)自Sigma公司。歐洲藥典LMWH標(biāo)準(zhǔn)品(美國(guó)USP公司）。兩批LMWH(依諾肝素鈉）注射液(克賽）200806和200912購(gòu)自法國(guó)賽諾菲·安萬(wàn)特(Sanofi Aventis）公司;供試品依諾肝素鈉(固體）20110401和20110402由杭州九源基因工程有限公司提供。

1.2 溶液配制

分別配制 0.50 mol/L Tris，1 mol/L NaCl，1 mol/L HCl和0.5 mol/L EDTA儲(chǔ)備液各500 mL。pH 8.4緩沖液的配制:分別量取一定量的Tris、NaCl和EDTA儲(chǔ)備液，用1 mol/L HCl調(diào)至pH 8.4，定容后溶液中含50 mmol/L Tris，175 mmol/L NaCl和7.5 mmol/L EDTA。pH 7.4緩沖液的配制:分別量取一定量的 Tris、NaCl，用1 mol/L HCl調(diào)至 pH 7.4，定容后溶液中含50 mmol/L Tris和150 mmol/L NaCl。FXa生色肽底物用超純水配制成3 mmol/L的儲(chǔ)備液，使用前用 pH 8.4緩沖液稀釋至0.5 mmol/L。

依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品溶液(S）:按0.78的劑間比，用 pH 7.4緩沖液分別稀釋，得到 0.087 IU/mL(S1）、0.111 IU/mL(S2）、0.143 IU/mL(S3）、0.183 IU/mL(S4）的工作溶液。依諾肝素鈉供試品溶液(TA）:克賽預(yù)估效價(jià)為10000 IU/mL，按劑間比0.78，用pH 7.4緩沖液分別稀釋，得到 0.087 IU/mL(T1）、0.111 IU/mL(T2）、0.143 IU/mL(T3）、0.183 IU/mL(T4）的工作溶液;供試品溶液(TB）:杭州九源提供的依諾肝素鈉預(yù)估效價(jià)為110 IU/mg，按照劑間比0.78，用pH 7.4緩沖液配制20 mg/mL的溶液，再分別稀釋，得到 0.087 IU/mL(T1）、0.111 IU/mL(T2）、0.143 IU/mL(T3）、0.183 IU/mL(T4）的工作溶液?？鼓窤TⅢ溶液:25 mL水溶解得1 IU/mL的溶液。凝血因子FXa溶液:10 mL水溶解得7.1 nkat/mL的溶液。所有溶液由超純水配制(Millipore UV超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司），緩沖液在使用前用0.45 μm的濾膜過(guò)濾。

1.3 SEC色譜分離條件

色譜柱:TSKgel MP(PW）-M預(yù)柱(35 mm×4.6 mm），工作范圍為DNA 500～5000 bp;流動(dòng)相A為H2O;流動(dòng)相 B為乙腈和 50 mmol/L NaH2PO4-H3PO4混合溶液(20∶80，v/v），pH 3.0，使用前用0.45 μm的微孔過(guò)濾膜過(guò)濾。洗脫條件為:0～1 min保持100%A;1～1.5 min從100%A線性過(guò)渡到100%B;1.5～8.5 min保持100%B;8.5～9 min線性梯度回到100%A;9～13.5 min保持100%A。檢測(cè)波長(zhǎng)385 nm;流速0.6 mL/min;柱溫25℃;進(jìn)樣量 5 μL。

1.4 低分子量肝素的活性測(cè)定

將液相色譜自動(dòng)進(jìn)樣器作為自動(dòng)的微酶反應(yīng)器。LMWH、ATⅢ、FXa和底物CPS依次進(jìn)樣，在進(jìn)樣器內(nèi)混合孵育反應(yīng)，然后用體積排阻色譜分離酶解產(chǎn)物。通過(guò)定量測(cè)定生成的pNA，實(shí)現(xiàn)LMWH活性的測(cè)定。在設(shè)定的自動(dòng)進(jìn)樣程序中，樣品瓶放置次序?yàn)?1#，水(清洗瓶）;2#，LMWH 樣品;3#，ATⅢ;4#，F(xiàn)Xa;5#，底物 CPS。進(jìn)樣程序?yàn)?從2#和3#瓶中分別抽取1 μL，混合3次，靜置1 min;從4#瓶中抽取2 μL，混合進(jìn)樣針內(nèi)的4 μL溶液3次，靜置1 min;從5#瓶中抽取5 μL，混合針內(nèi)的9 μL 溶液3次，靜置4 min;最后進(jìn)樣。按照優(yōu)化的色譜分離條件分離分析產(chǎn)物。

按照已經(jīng)優(yōu)化好的方法，變換LMWH的濃度，按照 S1、S2、S3、S4、T1、T2、T3、T4、T1、T2、T3、T4、S1、S2、S3、S4的排列順序測(cè)試16次，記錄下每次反應(yīng)產(chǎn)生的pNA的峰面積。以pNA的峰面積為縱坐標(biāo)，LMWHs標(biāo)準(zhǔn)品(或供試品）溶液濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)分別做線性回歸曲線，并按照生物活性測(cè)定的統(tǒng)計(jì)方法(中國(guó)藥典2005年版第二部附錄XIV）計(jì)算效價(jià)和實(shí)驗(yàn)誤差［13，14］。

1.5 血漿中低分子量肝素抗FXa活性的測(cè)定

測(cè)試血漿樣品中依諾肝素活性時(shí)未用自動(dòng)進(jìn)樣器。首先用pH 8.4的緩沖液分別配制0、0.1、0.2、1 IU/mL的依諾肝素鈉溶液。取20 μL某一濃度的依諾肝素鈉溶液與20 μL血漿混合，30℃水浴孵育2 min后加入40 μL FXa，混勻孵育2 min;加入40 μL CPS，混勻后置于30℃水浴孵育，計(jì)時(shí);分別在孵育5、10、15、20、30、45、60 min 時(shí)間節(jié)點(diǎn)取 9 μL反應(yīng)液，用6 μL 20%(體積分?jǐn)?shù)）乙酸溶液淬滅酶反應(yīng);取10 μL反應(yīng)液注入SEC分離，其他色譜條件與自動(dòng)進(jìn)樣分析相同。根據(jù)對(duì)硝基苯胺的峰面積隨時(shí)間變化曲線，并由每條曲線的斜率繪制血漿中依諾肝素的劑量反應(yīng)曲線［15］。

2 結(jié)果與討論

2.1 SEC方法的建立

樣品中主要含有 ATⅢ、FXa、人血清白蛋白、LMWHs、生色底物肽CPS和pNA。ATⅢ、FXa和人血清白蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量分別為62～67 kDa，43 kDa和67 kDa;依諾肝素鈉的平均相對(duì)分子質(zhì)量為4.5 kDa，底物CPS的相對(duì)分子質(zhì)量622.7 Da，pNA的相對(duì)分子質(zhì)量為138 Da。分離時(shí)，蛋白質(zhì)在柱內(nèi)無(wú)保留，首先洗脫出來(lái)，相對(duì)分子質(zhì)量越小的組分保留越強(qiáng)，洗脫時(shí)間越長(zhǎng)，從而實(shí)現(xiàn)各組分的分離。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在 TSKgel MP(PW）-M預(yù)柱上以150 mmol/L NaH2PO4-NaOH(pH 7.4）緩沖液作為流動(dòng)相，流速為0.35 mL/min時(shí)pNA在20.2 min時(shí)可以被洗脫出來(lái)，但CPS不能被洗脫出來(lái)，這是由于堿性的精氨酸使得肽吸附在色譜柱上。將緩沖液由中性調(diào)為酸性(pH 3.0），CPS能夠較快地洗脫出來(lái)，但是卻很難洗脫出 pNA。推測(cè)由于 TSKgel MP(PW）-M柱填料的親水性差，使得疏水性的pNA吸附在填料上。為了增強(qiáng)緩沖液對(duì)疏水性物質(zhì)的洗脫強(qiáng)度，在流動(dòng)相中加入一定量乙腈，同時(shí)也將流動(dòng)相中鹽的濃度降為50 mmol/L。如圖1所示，當(dāng)乙腈從10%增加到20%時(shí)，pNA的洗脫時(shí)間變短，柱效也大大提高。考慮到色譜柱對(duì)有機(jī)溶劑的承受力和分離效率，我們選用了含20%ACN的50 mmol/L NaH2PO4-H3PO4(pH 3.0）作為流動(dòng)相。

圖1 流動(dòng)相中有機(jī)溶劑濃度對(duì)pNA洗脫時(shí)間的影響Fig.1 Effect of organic composition in mobile phase on the elution time of pNA

盡管上述色譜條件可以滿足分離度和效率的要求，但pH 3.0的酸性緩沖液和乙腈都有可能引起蛋白的沉淀，所以采用兩種流動(dòng)相接力洗脫的方式。流動(dòng)相A為50 mmol/L NaH2PO4-H3PO4緩沖液(pH 7.4）;流動(dòng)相B為含20%ACN的50 mmol/L NaH2PO4-H3PO4緩沖液(pH 3.0）。先用流動(dòng)相A將蛋白等大分子洗脫出柱，再用流動(dòng)相B將CPS和pNA洗脫出來(lái)。但兩種pH值差異較大的洗脫液交替洗脫時(shí)產(chǎn)生大量的氣泡，分離效果差。所以將流動(dòng)相A改為純水，避免了氣泡的產(chǎn)生。最終選擇1.3節(jié)所述色譜洗脫條件。

在經(jīng)過(guò)優(yōu)化的洗脫條件下，血漿樣品中的蛋白、CPS、pNA被分離開，結(jié)果如圖2所示。傳統(tǒng)的分光光度法中，為了避免發(fā)色肽底物的干擾，只能選擇在405 nm的波長(zhǎng)下檢測(cè)，降低了檢測(cè)的靈敏度［8］。而在我們的方法中，由于pNA能與酶反應(yīng)液中其他成分分開，因此可以在其最大吸收波長(zhǎng)385 nm下檢測(cè)，獲得最佳的檢測(cè)靈敏度。如圖2所示，考察了不同檢測(cè)波長(zhǎng)下對(duì)硝基苯胺的峰面積，在385 nm下得到的峰面積(1288）比在405 nm下得到的峰面積(895）高40%。

2.2 方法驗(yàn)證

圖2 不同吸收波長(zhǎng)下標(biāo)準(zhǔn)品混合物分離的色譜圖Fig.2 Chromatograms obtained at different detection wavelengths

在優(yōu)化的色譜條件下考察了方法的重復(fù)性。pNA的洗脫時(shí)間和峰面積在日內(nèi)和日間的重復(fù)性列于表1中，該方法日間和日內(nèi)重復(fù)性的RSD均小于1%，具有優(yōu)良的方法重現(xiàn)性。

表1 對(duì)硝基苯胺的洗脫時(shí)間和峰面積在日內(nèi)與日間的重復(fù)性Table 1 Intraday and interday repeatabilities in terms of the retention time and peak area of pNA

隨后，我們對(duì)pNA的濃度與峰面積關(guān)系的線性范圍進(jìn)行了考察，在0.05～1 mmol/L的濃度范圍內(nèi)，r2為0.9998，線性關(guān)系良好。

2.3 LMHWs抗FXa的活性測(cè)定

2.3.1 在線酶反應(yīng)條件的選擇

首先考察了酶FXa在測(cè)試過(guò)程中的穩(wěn)定性。將FXa從4℃冰箱中取出，室溫下至少放置20 min后恢復(fù)活力［15］，用自動(dòng)進(jìn)樣器取 FXa溶液2 μL和CPS溶液5 μL混合3次，靜置4 min后進(jìn)樣分離。酶活性隨測(cè)試時(shí)間變化的趨勢(shì)如圖3所示。

圖3 室溫下FXa活性隨測(cè)試時(shí)間變化趨勢(shì)圖Fig.3 Time course of the FXa activity at room temperature

從圖3中可以看出，F(xiàn)Xa在室溫下放置200 min以內(nèi)，其活性基本保持不變，實(shí)驗(yàn)前后10個(gè)點(diǎn)的RSD為2.1%。200 min之后，酶活性衰減明顯。隨后考察了酶ATⅢ在室溫下的穩(wěn)定性，測(cè)試時(shí)先抽取1 μL的依諾肝素鈉溶液和1 μL的ATⅢ溶液，混合后靜置1 min，再抽取2 μL FXa混合并靜置1 min，最后抽取5 μL CPS混合后靜置4 min，進(jìn)樣分離。發(fā)現(xiàn)在室溫下放置40 min的FXa活力保持不變，再延長(zhǎng)放置時(shí)間，其活力會(huì)明顯衰減。因此在進(jìn)行肝素活性測(cè)試時(shí)每分析8次后，更換一次 FXa，每次使用前在室溫下放置20 min恢復(fù)活力。ATⅢ每次分析更換一次，每次使用前在室溫下放置20 min恢復(fù)酶活力。

2.3.2 LMWHs抗 FXa 的效價(jià)測(cè)定

將依諾肝素鈉標(biāo)準(zhǔn)品按照1∶0.78的劑間比配制一組梯度效價(jià)溶液(即 S1、S2、S3、S4）。對(duì)于供試品依諾肝素鈉，首先預(yù)估一個(gè)效價(jià)，再根據(jù)預(yù)估效價(jià)配制出與標(biāo)準(zhǔn)品效價(jià)濃度相同的梯度溶液，分別標(biāo)記為T1、T2、T3、T4。由于使用的是分離分析的方法，不需要扣除空白，所以省去了空白對(duì)照組。

用已經(jīng)優(yōu)化好的方法，按照以下順序:S1、S2、S3、S4，T1、T2、T3、T4，T1、T2、T3、T4，S1、S2、S3、S4測(cè)試16次，記錄下每次反應(yīng)中 pNA的峰面積。以pNA的峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品(或供試品）效價(jià)濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)分別做線性回歸曲線，并按照中國(guó)藥典2005年版第二部附錄XIV中生物檢定統(tǒng)計(jì)方法計(jì)算效價(jià)和實(shí)驗(yàn)誤差，平均可信限率(FL）不得大于15%，劑間、回歸需顯著，偏離平行、二次曲線、反向二次曲線需不顯著。

測(cè)試了克賽的兩批依諾肝素鈉試劑，以及由杭州九源公司提供的依諾肝素鈉。以標(biāo)準(zhǔn)品(或供試品）溶液濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)的線性回歸曲線都表現(xiàn)出良好的線性和雙平行線性質(zhì)(見圖4）。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用4×4量平行統(tǒng)計(jì)方法進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)(見表2）。

圖4 供試品和標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積與濃度對(duì)數(shù)值的線性回歸曲線Fig.4 Regression curves of the peak areas against the log concentrations of the test samples and a standard sample Lot No.:a.200806;b.200912;c.20110401;d.20110402.

本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果與標(biāo)示值結(jié)果接近，F(xiàn)L小于15%，可靠性檢測(cè)全部通過(guò)，劑間、回歸顯著，偏離平行、二次曲線、反向二次曲線不顯著?；赟EC測(cè)得的4批依諾肝素鈉的效價(jià)與它們由分光光度法測(cè)定的標(biāo)示效價(jià)一致。

表2 實(shí)驗(yàn)測(cè)得樣品效價(jià)Table 2 Determined potency of enoxaparin

2.4 血漿中低分子量肝素抗FXa活性研究

依諾肝素具有較好的藥物動(dòng)力學(xué)可預(yù)測(cè)性，因此對(duì)絕大部分病人而言不需要進(jìn)行血藥濃度的監(jiān)測(cè)。然而，對(duì)于一些特殊的受藥群體，如肥胖病患者、腎功能缺陷患者、孕婦、老人、兒童等，由于他們藥代動(dòng)力學(xué)的改變，國(guó)際血栓和止血協(xié)會(huì)(International Society of Thrombosis and Haemostasis）建議對(duì)依諾肝素的血藥濃度進(jìn)行監(jiān)測(cè)［16，17］。本文考察了血漿中依諾肝素在0～1 IU/mL范圍內(nèi)抗FXa活性的動(dòng)力學(xué)變化。圖5a為pNA紫外吸收強(qiáng)度隨時(shí)間變化的曲線。當(dāng)依諾肝素為0時(shí)，只需反應(yīng)5 min紫外吸光度值便可達(dá)1000 mAU以上;當(dāng)依諾肝素超過(guò)0.1 IU/mL時(shí)，紫外吸收強(qiáng)度隨反應(yīng)時(shí)間的增加緩慢增加。劑量反應(yīng)曲線是由紫外吸光強(qiáng)度曲線的線性區(qū)域計(jì)算出的斜率(反應(yīng)速率）與劑量關(guān)系的曲線(圖5b）。劑量反應(yīng)曲線中，反應(yīng)速率隨著LWMH的增加而減小。當(dāng)血漿中依諾肝素超過(guò)0.2 IU/mL時(shí)斜率值變化很小，即抗凝血效果顯著。通過(guò)測(cè)定血液中依諾肝素的抗凝血活性，由圖5b即可反推出依諾肝素在血液中的濃度。

3 結(jié)論

本文發(fā)展了一種基于SEC測(cè)試低分子量肝素抗FXa活性的方法，為低分子量肝素效價(jià)的測(cè)定提供了一個(gè)簡(jiǎn)單、高效、自動(dòng)化的方法，有助于低分子量肝素生產(chǎn)過(guò)程中的質(zhì)量控制。在自動(dòng)進(jìn)樣器上完成溶液的混合、反應(yīng)，大大簡(jiǎn)化了手工操作程序。只需使用一根長(zhǎng)30 mm的體積排阻色譜柱即可實(shí)現(xiàn)復(fù)雜酶反應(yīng)液中的生色底物、游離發(fā)色團(tuán)和各種蛋白的分離。因此對(duì)游離發(fā)色團(tuán)的定量不再受血漿中其他成分的干擾，拓展了樣品的應(yīng)用范圍。同時(shí)也可以在對(duì)硝基苯胺的最大吸收波長(zhǎng)下檢測(cè)而不用擔(dān)心受到底物在此波長(zhǎng)下的吸收干擾。并且該方法極大地減少了樣品的消耗量，大大地降低了成本。因此有可能用于各種復(fù)雜樣品中依諾肝素抗FXa活性的監(jiān)測(cè)，對(duì)肝素臨床治療和療效評(píng)價(jià)有著重要的意義。

圖5 SEC測(cè)量的抗FXa活性的動(dòng)力學(xué)變化曲線Fig.5 Pharmacokinetic profiles of SEC-based anti-FXa assay in the presence of enoxaparin(0－1 IU/mL）

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