胡青紅， 王超然， 李 靜，2， 王 彥， 谷 雪， 閻 超*

(1.上海交通大學(xué)藥學(xué)院，上海 200240;2.上海通微分析技術(shù)有限公司，上海 201203）

毛細(xì)管整體柱(monolithic column）是通過(guò)在毛細(xì)管內(nèi)原位聚合或固化的方法制備得到的具有多孔結(jié)構(gòu)的整體棒狀固定相，因其具有特殊的多孔結(jié)構(gòu)和簡(jiǎn)便的制備過(guò)程而受到關(guān)注［1］。其中，聚合物毛細(xì)管整體柱作為一種新型的色譜固定相，由于其比無(wú)機(jī)硅膠整體柱在生物相容性、pH穩(wěn)定性和修飾選擇性等方面更具有優(yōu)勢(shì)，自20世紀(jì)90年代被引入后，發(fā)展十分迅速［2，3］。Svec［4，5］和 Arrua 等［6］綜述了近些年來(lái)聚合物毛細(xì)管整體柱的最新進(jìn)展。

硼酸親和整體柱是一類具有特異親和性能的聚合物整體柱。它利用硼酸基團(tuán)能夠可逆結(jié)合含順二羥基結(jié)構(gòu)的化合物，生成穩(wěn)定的五元環(huán)原理來(lái)進(jìn)行特異性分離。其中以苯硼酸為功能基團(tuán)的硼酸親和材料用得最多。其反應(yīng)機(jī)理如圖1所示。在堿性條件(pH＞8）下，硼酸基團(tuán)經(jīng)過(guò)羥化從原來(lái)的三鍵共面結(jié)構(gòu)變成四面體硼酸陰離子，然后與順二羥基化合物形成酯環(huán);而在酸性條件下，此前產(chǎn)生的環(huán)狀酯水解，使反應(yīng)向反方向進(jìn)行［7，8］。整體柱滲透性好、傳質(zhì)快等優(yōu)勢(shì)結(jié)合硼酸親和色譜的專一性，非常適合于復(fù)雜樣品的分析。目前，硼酸親和整體柱主要用于生物樣品的分離分析，如碳水化合物［9，10］、糖蛋白［11－13］等的分離分析，而將其應(yīng)用于中藥及其提取物的分析還鮮有報(bào)道。

圖1 硼酸親和作用原理Fig.1 Schematic illustration of the boronic acid method

中藥提取物作為一類新興的天然藥物產(chǎn)品，正被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健等行業(yè)［14］。但中藥提取物成分復(fù)雜，且在很多中藥材中，一些小分子活性物質(zhì)的含量很低，往往要經(jīng)過(guò)多步提取、濃縮才能進(jìn)行測(cè)定。因而對(duì)這類小分子物質(zhì)的檢測(cè)，富集手段顯得尤為重要。硼酸親和整體柱因其專一的親和性，能夠特異性地結(jié)合含有順二羥基結(jié)構(gòu)的化合物，因此可以用于此類化合物的提取富集。本研究利用以4-乙烯基苯硼酸(VPBA）為功能單體，季戊四醇三丙烯酸酯(PETA）為交聯(lián)劑所制備的poly(VPBA-co-PETA）硼酸親和毛細(xì)管整體柱［15］選擇性地富集兩種常見(jiàn)中草藥—— 蒲公英和刺果衛(wèi)矛中的活性物質(zhì)，如綠原酸等，發(fā)現(xiàn)經(jīng)poly(VPBA-co-PETA）整體柱富集后，原樣品中被分析物的濃度顯著提高，達(dá)到了預(yù)期的效果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、試劑與材料

TriSepTM-2100加壓毛細(xì)管電色譜系統(tǒng)(美國(guó)Unimicro Technologies公司），包括溶劑輸送系統(tǒng)、柱上紫外/可見(jiàn)光檢測(cè)器、微流控系統(tǒng)、高壓電源和數(shù)據(jù)采集系統(tǒng);島津高效液相色譜儀(日本島津公司），包括LC-20AB泵、SPD-20A檢測(cè)器、DGU-20A3脫氣儀和LC solution工作站。石英毛細(xì)管(100 μm i.d.，365 μm o.d.，河北永年銳灃色譜器件有限公司）;0.22 μm水相、有機(jī)相濾膜(上海半島實(shí)業(yè)有限公司凈化器材廠）。

甲醇和乙腈(色譜純，美國(guó)TEDIA公司）;γ-甲基丙烯酰氧丙基三甲氧基硅烷(γ-MAPS，純度97%）、VPBA(純度 98%）、PETA(純度 98%）均購(gòu)于英國(guó)Alfa Aesa公司;偶氮二異丁腈(AIBN）、乙二醇和二甘醇購(gòu)于中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑有限公司;三氟乙酸(TFA）等其他試劑均為分析純。

蒲公英(Herba Taraxaci）、刺果衛(wèi)矛(Euonymus acanthocarpus）購(gòu)于河北省安國(guó)市伊康藥業(yè)有限公司，經(jīng)上海交通大學(xué)藥學(xué)院王夢(mèng)月副教授鑒定為菊科植物蒲公英的干燥全草和衛(wèi)矛科植物刺果衛(wèi)矛的干燥根。

1.2 毛細(xì)管整體柱的制備［15］

毛細(xì)管首先經(jīng)過(guò)堿洗、酸洗、甲醇沖洗等預(yù)處理步驟后進(jìn)行硅烷化反應(yīng)以修飾其內(nèi)壁;然后稱取單體VPBA、PETA、致孔劑乙二醇、二甘醇以及引發(fā)劑AIBN適量，混合均勻后抽入毛細(xì)管內(nèi)，置于75℃水浴中反應(yīng)12 h，得到poly(VPBA-co-PETA）硼酸親和整體柱。

1.3 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備

精密稱定咖啡酸、綠原酸對(duì)照品各1 mg，用少量甲醇溶解，配制成0.5 g/L的對(duì)照品儲(chǔ)備液，經(jīng)0.22 μm 濾膜過(guò)濾，備用。

精密稱定3，4-二羥基苯乙醇和2，3-二羥基苯甲酸芐酯精提物對(duì)照樣品各約10 mg，用少量甲醇溶解，配制成1 g/L儲(chǔ)備液，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾，備用。

所有樣品在4℃條件下避光保存，實(shí)驗(yàn)前用流動(dòng)相稀釋配制至所需濃度。

1.4 中藥樣品的處理

蒲公英:經(jīng)粉碎后稱取適量蒲公英粉末，加10倍質(zhì)量的甲醇超聲提取、過(guò)濾;濾渣中再加8倍量的甲醇超聲提取、過(guò)濾;合并兩次濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加水定容至一定體積，得其醇提液。取適量醇提液用水(醇提液與水的體積比為1∶4）分散后依次用石油醚、氯仿、乙酸乙酯和正丁醇萃取、回收，冷凍干燥后用甲醇定容成1 g/L儲(chǔ)備液。取正丁醇提取液，稀釋后進(jìn)樣。

刺果衛(wèi)矛:取刺果衛(wèi)矛粉末1 g，加甲醇20 mL，回流30 min，抽濾，濾液蒸干，殘?jiān)屑铀?0 mL，加熱使其溶解，抽濾，濾液用醋酸乙酯振搖提取2次(10 mL/次），合并醋酸乙酯液，蒸干，加甲醇使溶解，作為刺果衛(wèi)矛樣品儲(chǔ)備液。儲(chǔ)備液稀釋后進(jìn)樣。

1.5 色譜條件

1.5.1 毛細(xì)管液相色譜分析條件

毛細(xì)管poly(VPBA-co-PETA）硼酸親和整體柱柱長(zhǎng)45 cm(有效長(zhǎng)度25 cm）。流動(dòng)相:A相為乙腈-10 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH 8.5）(20∶80，v/v），B相為乙腈-1%乙酸(pH 2.8）(20∶80，v/v）;洗脫程序:先用堿性的A相平衡系統(tǒng)，待不保留物質(zhì)出峰(約10 min）后，切換至酸性的B相洗脫25 min;流速50 μL/min。檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。樣品環(huán)體積約為0.8 μL;分流比約為38∶1，實(shí)際進(jìn)樣量約為20 nL。

1.5.2 高效液相色譜分析條件

色譜柱:TSK gel ODS-100V(250 mm×4.6 mm）。流動(dòng)相:A 相為乙腈-水(10∶90，v/v;含0.1%TFA），B 相為乙腈-水(90∶10，v/v;含 0.1%TFA）;線性梯度洗脫程序:0～35 min，100%A～100%B。流速1 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為214 nm。

2 結(jié)果與討論

2.1 毛細(xì)管整體柱對(duì)蒲公英中活性物質(zhì)的富集

蒲公英提取物中富含酚酸類化合物，具有廣譜抗菌、抗氧化、消炎利膽、促進(jìn)新陳代謝等作用［16］。綠原酸和咖啡酸是其中主要的有效成分［17］(其結(jié)構(gòu)見(jiàn)圖2），兩者均是含有順二羥基結(jié)構(gòu)的化合物。

圖2 綠原酸和咖啡酸的分子結(jié)構(gòu)Fig.2 Molecular structures of chlorogenic acid and caffeic acid

2.1.1 綠原酸和咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品的分離

按1.5.2節(jié)的色譜條件對(duì)綠原酸和咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離，得到的圖譜見(jiàn)圖3a。從圖3a中可以看出，綠原酸和咖啡酸在高效液相色譜中分離效果良好，并依其極性的大小順序先后出峰，出峰時(shí)間分別為17.0 min左右和19.5 min左右。以此作為綠原酸和咖啡酸保留時(shí)間的參考標(biāo)準(zhǔn)。

2.1.2 蒲公英提取物中綠原酸和咖啡酸的分離

取制備好的蒲公英提取物樣品進(jìn)樣，按1.5.2節(jié)分析條件分離，得到的色譜圖如圖3b所示。從圖3b中可見(jiàn)，在17.0 min和19.5 min的位置只出現(xiàn)了極小的色譜峰，說(shuō)明蒲公英正丁醇提取液中綠原酸和咖啡酸的含量很少，直接檢測(cè)困難。

2.1.3 蒲公英提取物中綠原酸和咖啡酸富集后的分離

由于綠原酸和咖啡酸的分子結(jié)構(gòu)中含有順二羥基，所以能夠被poly(VPBA-co-PETA）硼酸親和整體柱特異捕獲。實(shí)驗(yàn)中，先用堿性流動(dòng)相平衡系統(tǒng)，取制備好的蒲公英提取物樣品進(jìn)樣富集分離，此時(shí)綠原酸和咖啡酸被保留在整體柱上，其余物質(zhì)被直接洗脫;將流動(dòng)相切換成酸性流動(dòng)相后，保留在整體柱上的綠原酸和咖啡酸被洗脫，收集洗脫液，按1.5.2節(jié)條件進(jìn)行HPLC檢測(cè)，得到的色譜圖如圖3c所示。由此可以看到，經(jīng)整體柱富集后，蒲公英提取物中綠原酸和咖啡酸的色譜峰顯著增大，表明poly(VPBA-co-PETA）整體柱能很好地富集提取樣品中的綠原酸和咖啡酸。

圖3 (a）綠原酸和咖啡酸標(biāo)準(zhǔn)品、(b）蒲公英提取物樣品直接進(jìn)樣和(c）經(jīng)親和整體柱富集后進(jìn)樣的高效液相色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of(a）a mixture of chlorogenic acid and caffeic acid standards，(b）an extract sample of Herba Taraxaci and(c）an extract sample of Herba Taraxaci after enrichment by the monolithic column

2.2 毛細(xì)管整體柱對(duì)刺果衛(wèi)矛中活性物質(zhì)的富集

為了進(jìn)一步考察poly(VPBA-co-PETA）整體柱對(duì)中藥中小分子活性物質(zhì)的富集作用，我們選擇了另一種中草藥刺果衛(wèi)矛。刺果衛(wèi)矛提取物中含有3，4-二羥基苯乙醇和2，3-二羥基苯甲酸芐酯等小分子活性物質(zhì)，這兩種化合物的結(jié)構(gòu)式如圖4所示，可見(jiàn)它們均含有順二羥基結(jié)構(gòu)，推測(cè)可以被poly(VPBA-co-PETA）親和整體柱特異性捕獲。

圖4 3，4-二羥基苯乙醇和2，3-二羥基苯甲酸芐酯的分子結(jié)構(gòu)圖Fig.4 Molecular structures of 3，4-dihydroxyphenylethanol and benzyl 2，3-dihydroxybenzoate

在1.5.2節(jié)條件下對(duì)3，4-二羥基苯乙醇和2，3-二羥基苯甲酸芐酯精提物的對(duì)照品進(jìn)行HPLC分離，結(jié)果分別如圖5a和圖5b所示。它們?cè)诜聪嘁合嗌V柱上的保留時(shí)間分別約為17 min和31 min。出峰順序與其極性大小順序一致。

圖5 (a）3，4-二羥基苯乙醇精提物對(duì)照樣品、(b）2，3-二羥基苯甲酸芐酯精提物對(duì)照樣品、(c）刺果衛(wèi)矛提取物樣品直接進(jìn)樣和(d）經(jīng)親和整體柱富集后進(jìn)樣的高效液相色譜圖Fig.5 HPLC chromatograms of(a）3，4-dihydroxyphenylethanol reference， (b）benzyl 2，3-dihydroxybenzoate reference，(c）an extract sample of Euonymus acanthocarpus and(d）an extract sample of Euonymus acanthocarpus after enrichment by the monolithic column

在同樣的分析條件下對(duì)刺果衛(wèi)矛提取物直接進(jìn)樣分析。從圖5c中可見(jiàn)，刺果衛(wèi)矛提取物中大約有10余種活性物質(zhì)，在17 min處3，4-二羥基苯乙醇的出峰位置只有一個(gè)很小的色譜峰，在31 min處2，3-二羥基苯甲酸芐酯的出峰位置幾乎看不到色譜峰，說(shuō)明刺果衛(wèi)矛提取物中3，4-二羥基苯乙醇和2，3-二羥基苯甲酸芐酯的含量很低，直接用HPLC分析檢測(cè)不到。將上述樣品經(jīng)過(guò)poly(VPBA-co-PETA）硼酸親和整體柱后，收集酸性條件下的洗脫液，然后進(jìn)行HPLC分析，得到的色譜圖見(jiàn)圖5d。與圖5c對(duì)比可看出，經(jīng)硼酸親和整體柱富集后，在17 min和31 min均有明顯的色譜峰出現(xiàn)，說(shuō)明3，4-二羥基苯乙醇和2，3-二羥基苯甲酸芐酯被很好地富集在硼酸親和柱上，使得其濃度顯著提高，從而得到檢測(cè)。

3 結(jié)論

本研究在自制的poly(VPBA-co-PETA）硼酸親和整體柱上可以特異性地捕獲含有順二羥基的化合物。在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們將其用于蒲公英中的綠原酸和咖啡酸、刺果衛(wèi)矛中的3，4-二羥基苯乙醇和2，3-二羥基苯甲酸芐酯等含順二羥基結(jié)構(gòu)的小分子活性物質(zhì)的富集，使其色譜峰響應(yīng)顯著提高，達(dá)到了檢測(cè)要求，為中藥中低含量活性物質(zhì)的分離檢測(cè)提供了新的思路。

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