楊 升，賈東平，劉家慧

（1.天津農(nóng)學(xué)院，天津 300384；2.青島濱海學(xué)院，山東 青島 266555）

自1956年P(guān)olge首次利用冷凍精液人工授精獲得仔豬至今，豬精液冷凍技術(shù)雖然經(jīng)過(guò)多年的發(fā)展，但與奶牛冷凍精液的應(yīng)用相比，仍有很大差距。早在1930年，Milovanov等對(duì)豬人工授精進(jìn)行了試驗(yàn)，并提出最初的豬精液稀釋劑(葡萄糖-硫酸鹽和葡萄糖-酒石酸鹽)。近年來(lái)豬精液冷凍保存液中非滲透性保護(hù)劑糖類物質(zhì)的加入引起了研究人員的高度關(guān)注，糖類在生物活性細(xì)胞脫水的情況下在細(xì)胞膜外形成一層保護(hù)膜，從而在冷凍過(guò)程中保護(hù)細(xì)胞膜的完整性，最終達(dá)到保護(hù)精子的作用。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

天津某種豬場(chǎng)提供的1.5～2歲、體格健壯、性欲旺盛的8頭約克夏種公豬。

1.1.2 試驗(yàn)藥品

Hepes (H-3375)，Hoechst33342(H33342 ；B-2261)， Propidium Iodide(PI; P-4170)，F(xiàn)luorescein-labeled lectin from Arachis hypogaea(FITC-PNA; L-7381)， Anhydrous Dimethyl Sulfoxide (DMSO；D-2650)和 Bovine Serum Albumin (BSA；A-4503)等及一些常用試驗(yàn)藥品如葡萄糖；檸檬酸；檸檬酸鈉等均購(gòu)自 Sigma化學(xué)公司（St. Louis, MO，美國(guó)），Mito Tracker? Orange CMTMRos(MITO, M-7510)，Yo-Pro-1 (Y-3603)和 erocyanine 540(M24571)購(gòu)自分子探針公司（Eugene, OR，美國(guó)），其他試劑為國(guó)產(chǎn)分析純均為市售藥品。

1.1.3 液體的配制

ZO液： 葡 萄 糖1.15 g，EDTA 0.23 g，檸檬酸鈉1.17 g，碳酸氫鈉0.125 g，Tris 0.65 g， 檸 檬 酸 0.41 g，半膚胺0.01 g，BSA 0.5 g；

冷凍液I：葡萄糖1.5 g，乳糖3.0 g，甘氨酸8 g，卵黃24 mL/l00 mL；

冷凍液II：在I液中加入6%甘油。

1.2 設(shè)備

高速離心機(jī) Eppendorf centrifuge 5810R，德國(guó)

水浴鍋 W20M-2E，美國(guó)

超純水儀 Millpore，法國(guó)

高壓滅菌鍋 HV-110，日本

超凈工作臺(tái) ESCO，新加坡

精子貯藏冰箱 Hisense BC-50，中國(guó)北京

移液器 EPPENDORF，德國(guó)

熒光正置顯微鏡 Nikon ECLIPSE 50i，日本

偉力彩色精子質(zhì)量檢測(cè)系統(tǒng)（CASA）WLJY-9000，中國(guó)北京

2 試驗(yàn)方法

2.1 精液的采集

精液采集采用手握法，采精后選擇中段精液，經(jīng)4層消毒紗布過(guò)濾去除膠狀物，收集精子富集部分。精液采集后立即用顯微鏡進(jìn)行常規(guī)品質(zhì)檢查，精子活率在0.7以上、色澤為乳白色的精液，在35～37 ℃于1 h內(nèi)運(yùn)抵實(shí)驗(yàn)室備用。

2.2 精液稀釋與冷凍

在室溫條件下，過(guò)濾后的精液先用常溫保存液ZO液按照（V/V)稀釋，避光靜置1 h后以2 400 g離心3 min去上清再添加冷凍稀釋I液，于5 ℃平衡1 h再添加等量的稀釋II液，使甘油的工作濃度為3%，繼續(xù)在5 ℃平衡1～3 h裝入0.25 mL細(xì)管，用聚乙烯醇粉末封口，單層放置液氮面上3 cm平衡10 min后直接投入液氮保存，凍精解凍時(shí)，從液氮中取出細(xì)管，迅速投入37 ℃水浴30 s，然后稀釋至2 mL解凍液中，室溫放置10 min待檢。

2.3 凍精質(zhì)量評(píng)定

2.3.1 精子活力

移液槍取10 μL精液于載玻片上，置于37 ℃恒溫載物臺(tái)上，在400×顯微鏡下評(píng)定精子活力（直線前進(jìn)），每個(gè)片子至少檢查200個(gè)精子。

2.3.2 質(zhì)膜完整性

將解凍后的精液用果糖-檸檬酸鈉低滲液稀釋，調(diào)整精子密度為 1×106～ 2×106/mL，37 ℃ 孵 育30 min后，取20 μL精子懸液于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，400×倒置顯微鏡下觀察不同部位5個(gè)視野，每次至少數(shù)200個(gè)精子，計(jì)算彎尾精子的百分率。

2.3.3 頂體完整性

將解凍后的精液滴到含3%等溫PVP液的離心管內(nèi)，800×g離心6 min，棄上清液；沉淀精子用37 ℃的PBS溶液重懸，調(diào)整精子密度為(1～2)×106/mL。移液槍吸取30 μL精子懸液，涂片，空氣中自然干燥后，用純甲醇固定10 min，再加入30 μL FITC-PNA染液，37 ℃、黑暗潮濕環(huán)境下孵育30 min。之后再用PBS溶液沖洗，空氣中自然干燥后加少許增光劑混勻，蓋上蓋玻片，盡快用400×熒光顯微鏡觀察。每次檢測(cè)時(shí)，每個(gè)片子計(jì)數(shù)200個(gè)精子。

2.3.4 精子獲能

首 先 在50 μL精 液 中 加 入500 μLHepes緩沖液，以 500 g離心5 min，棄掉上清，用 20 μL Hepes緩沖液重懸沉淀。染色時(shí)，將處理的精液加入100 μL添加有0.025 μL H33342、2 μLMerocyanine540 和 2 μLYo-Pro-1基礎(chǔ)液的Hepes緩沖液中，混勻后在37 ℃水浴中避光平衡20 min；然后用同樣的方法對(duì)染色后的精液進(jìn)行離心洗滌。最后取5 μL處理后的精液于載玻片，用上述方法對(duì)精子的獲能狀況進(jìn)行檢測(cè)。其中，非膜滲透性的核酸熒光染料Yo-Pro-1，標(biāo)記細(xì)胞膜受損的和去穩(wěn)定的精子細(xì)胞核，呈現(xiàn)綠色熒光；M540 使有活力的精子（未被 Yo-Pro-1 染色）呈現(xiàn)2種類型的熒光，熒光弱的表示精子未獲能，而熒光強(qiáng)的表示精子獲能。

3 試驗(yàn)方案

1）以ZO液為基礎(chǔ)液，進(jìn)行前期的處理，對(duì)照組使用冷凍液I和II進(jìn)行冷凍，試驗(yàn)組用水蘇糖代替冷凍液I中的葡萄糖和乳糖，并調(diào)節(jié)水蘇糖的劑量進(jìn)行最適劑量的選擇。

2）以前一步篩選的水蘇糖的劑量進(jìn)行試驗(yàn)，觀察水蘇糖在精子冷凍過(guò)程中對(duì)精子生理參數(shù)的影響。

4 統(tǒng)計(jì)分析

通過(guò)SPSS統(tǒng)計(jì)軟件，利用t檢驗(yàn)和方差分析進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

5 結(jié)果與分析

5.1 添加水蘇糖濃度的篩選

精液解凍后，用不同熒光染色劑進(jìn)行特異性染色，根據(jù)激發(fā)熒光不同利用熒光顯微鏡分別評(píng)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

從表1可以看出，不同添加劑量的水蘇糖對(duì)精子凍后活力具有很大影響，水蘇糖在稀釋液中的最佳添加量為4.5 g，此時(shí)對(duì)精子的保護(hù)作用最強(qiáng)，精子凍后效果最佳。隨著水蘇糖添加比例的增減對(duì)精子的保護(hù)效果不同，其適宜的添加量為4.5 g。根據(jù)試驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，在此冷凍配方中可以用水蘇糖代替葡萄糖和乳糖，其冷凍效果比原來(lái)配方的冷凍效果好。

表1 不同濃度水蘇糖對(duì)解凍精子活力的影響

5.2 添加水蘇糖對(duì)解凍后精子質(zhì)膜的影響

從表2可知，在4.5 g的添加量時(shí)水蘇糖在冷凍-解凍過(guò)程中對(duì)豬精子起到較好的保護(hù)作用，水蘇糖顯著提高凍后精子的頂體完整性，頂體完整率最高達(dá)到69.4%。而隨著添加比例的增加，精子的頂體完整率逐漸提高，各濃度水平間差異顯著。

表2 不同添加濃度水蘇糖對(duì)豬凍精質(zhì)膜完整性的影響

5.3 添加水蘇糖對(duì)解凍后精子頂體完整性的影響

精子頂體覆蓋了精子頭部的80%，含有能穿透卵細(xì)胞外卵丘和透明帶的酶，如果受到損傷，精子就會(huì)失去使卵子受精的能力。同樣，如果精子質(zhì)膜受到損傷或者發(fā)生變化，直接導(dǎo)致精子活力和受精能力下降。從表3可知，在4.5 g的添加量時(shí)水蘇糖在冷凍-解凍過(guò)程中對(duì)豬精子起到較好的保護(hù)作用。

表3 水蘇糖對(duì)解凍后精子頂體完整性的影響

5.4 添加水蘇糖對(duì)解凍后精子獲能的影響

在冷凍-解凍過(guò)程中，精子的獲能狀態(tài)可主要由Ca2+濃度及其分布確切反映。水蘇糖可以進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的高濃度Ca2+區(qū)間，且與Ca2+結(jié)合，而水蘇糖-Ca2+復(fù)合物容易與細(xì)胞膜內(nèi)的疏水區(qū)結(jié)合，在熒光顯微鏡下根據(jù)激發(fā)熒光的強(qiáng)度和分布，反映獲能過(guò)程中精子各時(shí)期Ca2+短暫的變化和分布規(guī)律，從而分析精子頂體完整狀態(tài)。不同添加比例對(duì)水蘇糖獲能處理前后精子的獲能情況的影響見(jiàn)表4。

表4 水蘇糖對(duì)解凍后精子獲能的影響

從表4可見(jiàn)，在獲能處理前，與對(duì)照組相比，水蘇糖可以明顯地降低冷凍-解凍過(guò)程中精子的獲能百分率，在4.5 g的添加比例時(shí)精子獲能率僅3.68%。從獲能處理后精子的獲能情況分析，添加水蘇糖可以顯著提高凍后精子的獲能潛力，其最佳添加量為4.5 g，獲能精子的百分率為28.6%，隨著體外觀察時(shí)間的延長(zhǎng)，精子的獲能也有所增加。

6 討論與結(jié)論

從本研究可以看出，稀釋液中添加25%的水蘇糖可以明顯提高冷凍-解凍后精子的活率、活力、線粒體活性和質(zhì)膜完整性等。隨著水蘇糖添加比例的增加，精子的頂體完整率越高，說(shuō)明水蘇糖可以有效保護(hù)冷凍-解凍過(guò)程中精子頂體的完整性，與Bayarad等在山羊精子冷凍保存的研究結(jié)果一致[1]；在保護(hù)精子質(zhì)膜方面，也與本研究結(jié)論一致[1]。但是，關(guān)于對(duì)凍后水蘇糖精子活率的影響與Aboagla等在山羊和Woelders等在牛精子冷凍方面的研究結(jié)論不同[2-3]，這可能是由于不同種家畜其精子對(duì)不同稀釋液滲透壓的耐受能力不同，豬精子對(duì)高滲溶液的耐受性較山羊精子和牛精子差，滲透壓的升高導(dǎo)致精子迅速脫水死亡的緣故。水蘇糖是一種穩(wěn)定的非還原性雙糖，對(duì)生物體或生物大分子具有獨(dú)特的非特異性保護(hù)作用，研究發(fā)現(xiàn)，水蘇糖作為一種水分替代分子，冷凍過(guò)程中避免了細(xì)胞膜在固相-液相轉(zhuǎn)變中受傷害，在細(xì)胞內(nèi)主要作為一種親和性溶質(zhì)來(lái)抗衡胞外的滲透壓變化。關(guān)于水蘇糖保護(hù)細(xì)胞的分子理，不同學(xué)者提出不同學(xué)說(shuō)，但眾多研究表明，水蘇糖的保護(hù)機(jī)制與其晶體結(jié)構(gòu)、溶液的物理構(gòu)和化學(xué)特性密切相關(guān)[4-5]。在精子冷凍時(shí)，水蘇糖可強(qiáng)有力地束縛水分子，與膜脂質(zhì)共同擁有結(jié)合水者本身起到代替膜結(jié)合水的功用，保持細(xì)胞內(nèi)濕潤(rùn)，防止細(xì)胞因失水而造成養(yǎng)分的損失和細(xì)胞的損傷，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜和蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特性。

[1]Bayarad M N, et al.The effect of antioxidants on post-thawed Angora goat (Capra hircus ancryrensis)sperm parameters, lipid peroxidation and antioxidant activities[J].Small Ruminant Research,201089(1):24-30.

[2]Woelders, D. and M. Kurpisz,Reactive oxygen species and sperm cells [J]. Reprod Biol Endocrinol,2004，2(12):1-7.

[3]Aboagla, S.G., H2O2, a necessary evil for cell signaling [J]. Science,2006, 312(5782): 1882-1883.

[4]Bansal,A.K.and G.S.Bilaspuri,Impacts of Oxidative Stress and Antioxidants on Semen Functions.Veterinary Medicine International，2011.

[5]Garrido N, et al. Pro-oxidative and anti-oxidative imbalance in human semen and its relation with male fertility [J].Asian journal of andrology, 2004， 6(1): 59-66.