張 敏，王慧娟，林 冰，趙 致，周 英，3*

(1.貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽550025;2.貴州大學(xué)貴州省中藥(民族藥)創(chuàng)制工程中心，貴州貴陽550025;3.貴州大學(xué)貴州省中藥材繁育與種植重點(diǎn)(工程)實(shí)驗(yàn)室，貴州貴陽550025)

太子參為石竹科Caryophyllaceae植物孩兒參Pseudostellaria heterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根，始見于清代的《本草從新》。黃文哲等在研究太子參6個不同極性提取物對小鼠免疫功能的影響時，發(fā)現(xiàn)太子參中的苷類和多糖等大極性成分是太子參提高機(jī)體免疫功能的有效物質(zhì)［1］;熊和健等通過研究太子參提取物體外抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)太子參皂苷粗提物具有明顯抗氧化活性［2］。

雖然太子參皂苷的藥理作用已經(jīng)逐漸明確，但關(guān)于太子參皂苷的含量測定研究還較為鮮見。由于缺少對照品，目前使用最多的方法是太子參藥材粉末經(jīng)水提醇沉后，濾液用正丁醇萃取后制備成供試液，以人參皂苷為標(biāo)準(zhǔn)品，應(yīng)用香草醛－高氯酸顯色后于可見光區(qū)測定［3］。但該方法工作量較大，工作效率較低，易造成總皂苷的損失，導(dǎo)致測定結(jié)果偏低。因此，本研究參照人參、重樓等貴重藥材的總皂苷測定方法，旨在缺少太子參皂苷自身對照品的情況下，建立太子參總皂苷含量的快速測定法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試藥 太子參藥材粉末，購于貴州省藥材公司。

1.1.2 儀器與試劑FA2004型分析天平(上海良平儀器儀表有限公司);恒溫水域鍋(金壇市大地自動化儀器廠);SHZ－95B型循環(huán)水壓式多用真空泵(上海予正儀器設(shè)備有限公司);SG8200HPT超聲波清洗器(上海冠特超聲儀器有限公司);SZ－93A自動雙重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠);GZX－9146MBE數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱(上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠);722S可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)。人參皂苷Rb1(中國食品藥品檢定研究院);無水乙醇(AR，重慶川東化工集團(tuán)有限公司);濃硫酸(AR，重慶川東化工集團(tuán)有限公司);香草醛(AR，天津市科密歐化學(xué)試劑開發(fā)中心);高氯酸(AR，成都金山化學(xué)試劑有限公司);冰乙酸(AR，天津市永大化學(xué)試劑有限公司);甲醇(AR，重慶川東化工集團(tuán)有限公司);正丁醇(AR，成都金山化學(xué)試劑有限公司);雙蒸水(自制)。

1.2 方法

1.2.1 供試液制備單因素考察 根據(jù)文獻(xiàn)中人參皂苷的超聲波半微量提取快速測定法［4］，稱取過藥典5號篩的太子參藥材粉末0.1 g于具塞錐形瓶中，加入25 mL溶劑，超聲40 min(功率500 W，頻率50 Hz)，取出后抽濾，取5 mL續(xù)濾液于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，作為供試液。取供試液2 mL置于10 mL具塞試管中，于沸水浴下?lián)]去溶劑，加入5%的香草醛－冰醋酸溶液(用前臨時配制)0.2 mL和0.8 mL高氯酸混勻，密塞，置60℃水浴中加熱20 min后取出，用冷水冷卻后，加入5 mL冰醋酸，搖勻。另取相同體積甲醇為空白對照，于560 nm波長處測定吸光度，并計算總皂苷占生藥的含量(%)。

(1)提取溶劑考察。分別以甲醇、無水乙醇、水飽和的正丁醇為提取溶劑，制備太子參供試液，測定總皂苷含量分別為2.72%、0.66%、2.14%。使用不同提取溶劑，供試液中引入的雜質(zhì)不同。根據(jù)文獻(xiàn)報道，太子參中所含的皂苷總量不超過1.0%［3］。因此，選用無水乙醇為溶劑時所制得的皂苷供試液中雜質(zhì)最少。本研究選用無水乙醇為提取溶劑。

(2)料液比的篩選。稱取過藥典5號篩的太子參藥材粉末0.1 g于具塞錐形瓶中，分別加入10、15、20、25 mL無水乙醇溶液，超聲提取后測定總皂苷含量分別為0.62%、0.73%、0.71%、0.66%。皂苷含量與加入的溶劑量為非正相關(guān)關(guān)系，溶劑量增大到一定值，皂苷含量反而減少。當(dāng)稱取0.1 g藥材加入15 mL無水乙醇時，所制得的供試液中總皂苷含量最高。因此，本研究選擇加入15 mL無水乙醇制備供試液。

(3)藥材粒度的篩選。分別稱取過藥典3、5、6、7、8號篩的樣品藥材0.1 g，再分別加入15 mL無水乙醇溶液，超聲提取后測定總皂苷含量分別為0.48%、0.73%、0.74%、0.75%、0.74%。當(dāng)藥材粒度為過藥典7號篩時所測得的皂苷含量最高。而過藥典8號篩與過藥典6號篩所測定的結(jié)果一致，可能是由于過8號篩的藥材粒度過小，部分藥渣堵塞濾紙，導(dǎo)致結(jié)果偏低。因此，本研究選用過藥典7號篩的藥粉進(jìn)行測定。

(4)提取時間的篩選。分別稱取樣品藥材粉末0.1 g(過藥典7號篩)加入15 mL無水乙醇后，分別超聲提取20、30、40、60、90、120、150 min，測定總皂苷含量分別為0.45%、0.65%、0.75%、0.76%、0.78%、0.79%、0.73%。試驗(yàn)可知，提取時間為120 min時制備的供試液皂苷含量測定值最高。在120 min之前測定的皂苷含量隨提取時間的增加而升高。當(dāng)提取時間為150 min時，測定結(jié)果明顯降低，可能是由于超聲150 min后，提取溶劑升溫，導(dǎo)致部分待測成分結(jié)構(gòu)改變，使測定結(jié)果降低。由于提取90 min與提取120 min皂苷測定值基本相等，考慮到工作效率，本研究選用提取90 min進(jìn)行測定。

1.2.2 供試液制備 稱取太子參藥材粉末0.1 g(過藥典7號篩)，加入無水乙醇15 mL，超聲提取90 min，過濾后取續(xù)濾液5 mL于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，作為供試液備用。

1.2.3 供試液顯色系統(tǒng)篩選 鑒于太子參總皂苷測定中缺少從太子參中分離得到的對照品，因此，選用化學(xué)結(jié)構(gòu)相近的人參皂苷Rb1對照考察了供試液測定時的顯色系統(tǒng)。取太子參供試液2 mL于具塞試管中，水浴揮干溶劑后，分別按下列顯色系統(tǒng)于560 nm處進(jìn)行顯色反應(yīng)，測定吸光度;同時稱取10.76 mg人參皂苷Rb1用甲醇溶解并定容于25 mL容量瓶中，混合均勻后，取0.2 mL于具塞試管中，水浴揮干溶劑，分別按下列顯色系統(tǒng)進(jìn)行顯色反應(yīng):

(1)加入高氯酸5 mL，置25℃水浴中保溫20 min，取出冷卻至室溫后測定［5］。

(2)加入5%香草醛－冰醋酸溶液0.2 mL，搖勻后，加入60%硫酸溶液5 mL，混合均勻后于60℃水浴中保溫20 min，取出冷水冷卻后測定［6］。

(3)加入8%香草醛－乙醇溶液0.2 mL，搖勻后，加入60%硫酸溶液5 mL，混合均勻后于60℃水浴中保溫20 min，取出冷水冷卻后測定［6］。

(4)加入5%香草醛－冰醋酸溶液0.2 mL，搖勻后，加入高氯酸0.8 mL，混合均勻后于60℃水浴中保溫20 min，取出冷水冷卻后加入5 mL冰醋酸溶液，搖勻后測定吸光度［7］。

(5)稱取香草醛0.1 g于10 mL的容量瓶中，加入2 mL冰醋酸和8 mL高氯酸，配置成5%香草醛－冰醋酸和高氯酸的1∶4的混合液，取上述混合液1 mL，于樣品具塞試管中搖勻后，置于60℃水浴中保溫20 min，取出冷水冷卻后加入5 mL冰醋酸溶液，搖勻后測定吸光度［8］。

每種顯色系統(tǒng)分別用太子參皂苷供試液和人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)液(0.45 mg/mL，每次0.2 mL參與反應(yīng))同步測定初始吸光度(A0min)和60 min時的吸光度(A60min)，并計算吸光度的改變率。綜合考察顯色系統(tǒng)的靈敏度和穩(wěn)定性，篩選顯色系統(tǒng)。吸光度的改變率計算公式如下:

1.2.5 供試液制備正交設(shè)計優(yōu)化 由單因素考察試驗(yàn)可知，當(dāng)選定提取溶劑后，藥材顆粒度、料液比、提取時間3個因素對總皂苷含量影響較大，因此，以這3個因素設(shè)計了L9(34)3因素3水平的正交試驗(yàn)(表1)。

表1 正交試驗(yàn)方案Tab.1 The factors and levels of orthogonal test

1.2.4 方法學(xué)考察

(1)線性關(guān)系考察。對照品溶液制備:稱取人參皂苷Rb1對照品4.5 mg，置25 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)溶液。

標(biāo)準(zhǔn)曲線制備:吸取對照品溶液0.1、0.2、0.4、0.8、1.6 mL，分別置于10 mL具塞試管中，于水浴下?lián)]去溶劑，加入5%香草醛－冰醋酸溶液0.2 mL，搖勻后，加入60%硫酸溶液5 mL，混合均勻后于60℃水浴中保溫20 min，取出冷水冷卻后測定吸光度。以甲醇為空白對照，于560 nm波長處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以人參皂苷Rb1對照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，測得的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

(2)精密度試驗(yàn)。按1.2項(xiàng)下太子參皂苷供試液制備的方法，制備皂苷供試液，吸取供試液2 mL，按上述線性關(guān)系中測定方法，從“水浴下?lián)]去溶劑”開始測定吸光度，計算RSD值。

(3)穩(wěn)定性試驗(yàn)。按1.2項(xiàng)下太子參皂苷供試液制備的方法，制備皂苷供試液，吸取供試液2 mL，按上述線性關(guān)系中測定方法，從“水浴下?lián)]去溶劑”開始，每隔20 min測定1次吸光度，計算RSD值。

(4)重復(fù)性試驗(yàn)。按1.2項(xiàng)下太子參皂苷供試液制備的方法，平行稱取6份太子參藥材，制備太子參皂苷供試液，吸取供試液2 mL，按上述線性關(guān)系中測定方法，從“水浴下?lián)]去溶劑”開始，測定吸光度并計算RSD值。

(5)加樣回收率試驗(yàn)。稱取已知總皂苷含量的樣品粉末0.05 g(過7號篩)，平行稱取5份，分別加入相同質(zhì)量的人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品0.4 mg。按1.2項(xiàng)下太子參皂苷供試液制備的方法，制備皂苷供試液，取供試液2 mL，按上述線性關(guān)系中測定方法，從“水浴下?lián)]去溶劑”開始，測定吸光度，計算平均回收率以及RSD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯色系統(tǒng)篩選

由于太子參總皂苷的含量是以人參皂苷Rb1標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定的，在選擇顯色系統(tǒng)時要綜合考慮人參皂苷Rb1和太子參皂苷供試液對顯色系統(tǒng)的靈敏性及穩(wěn)定性。由試驗(yàn)結(jié)果可知(表2)，顯色系統(tǒng)②的靈敏性與穩(wěn)定性都相對最高，因此，選定②號顯色系統(tǒng)進(jìn)行測定。即:向已揮干溶劑的供試液具塞試管中加入5%香草醛－冰醋酸溶液0.2 mL，搖勻后，加入60%硫酸溶液5 mL，混合均勻后于60℃水浴中保溫20 min，取出冷水冷卻后于560 nm處測定吸光度。

表2 顯色系統(tǒng)考察結(jié)果Tab.2 Results of color conditions inspection

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

由單因素考察試驗(yàn)可知，當(dāng)選定提取溶劑后，藥材顆粒度、料液比、提取時間3個因素對總皂苷含量影響較大，因此，以這3個因素設(shè)計了L9(34)3因素3水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果見表3。從表3可見，A2B3C3為較優(yōu)的總皂苷供試液制備條件，即太子參總皂苷供試液制備方法為:稱取太子參藥材粉末0.1 g(過藥典7號篩)，加入無水乙醇20 mL，超聲提取120 min，過濾后，取續(xù)濾液5 mL于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，作為供試液。

2.3 線性關(guān)系與方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 線性關(guān)系 以人參皂苷Rb1對照品溶液濃度(μg/mL)為橫坐標(biāo)，測得的吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)。得到回歸方程:A=0.017 6C+0.011 3，R2=0.999 5，線性范圍:7.94～40.89 μg/mL。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The results of orthogonal test

圖1 人參皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 The standard curve of ginsenside Rb1

2.3.2 精密度試驗(yàn) 按1.2項(xiàng)下太子參皂苷供試

液制備的方法，制備太子參供試液，連續(xù)測定5次，吸光度分別為0.155、0.152、0.156、0.154、0.154，計算得到RSD值為0.96%，表明儀器精密度良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按1.2項(xiàng)下太子參皂苷供試液制備的方法，制備太子參供試液，分別測定0、20、40、60、80、100 min時的吸光度，分別為0.155、0.152、0.154、0.156、0.154、0.155，計算得到RSD值為0.88%，表明該測定方法于1 00 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按1.2項(xiàng)下太子參皂苷供試液制備的方法，平行稱取6份同一批次太子參藥材，制備太子參供試液，測定皂苷含量。計算得到RSD值為1.97%(表4)，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 平行稱取5份已知皂苷含量的同一產(chǎn)地太子參藥材，分別加入人參皂苷0.4 mg，按1.2項(xiàng)下太子參皂苷供試液制備的方法，制備太子參供試液，測定皂苷含量。計算RSD值為1.25%，平均回收率為98.82%(表5)，表明該方法準(zhǔn)確度良好。

表4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Tab.4 Results of repeatability test

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.5 Results of sample recover test

3 討論

3.1 太子參皂苷不僅具有增強(qiáng)免疫力等藥理作用［1］，其含量還可以在一定程度上表征太子參生長的環(huán)境變化［9］，因此，太子參的皂苷含量在太子參的質(zhì)量控制中具有重要作用。目前，由于太子參皂苷在測定中缺少自身標(biāo)準(zhǔn)品，所測得的含量多為一種模糊值，使太子參的質(zhì)量控制受限。本試驗(yàn)得到的超聲波半微量提取測定法，較其他方法具有快捷、靈敏、取樣少等優(yōu)點(diǎn)，在缺少太子參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品的測定研究中，具有一定的應(yīng)用價值。但若想使太子參皂苷作為一個指標(biāo)性成分在太子參質(zhì)量控制中得到更好的應(yīng)用，還需要在太子參皂苷標(biāo)準(zhǔn)品方面深入研究。

3.2 超聲波是一種機(jī)械波，在不均勻介質(zhì)中傳遞時會發(fā)生散射衰減，試驗(yàn)超聲提取時，樣品整體作為一種介質(zhì)在各方向上是不均勻的，到達(dá)樣品內(nèi)部的超聲機(jī)械能量會有一定程度的衰減，從而影響提取效果［4］。本試驗(yàn)采用0.1 g的藥材用量，其原因:一是可以使藥材不受震動、搖晃等影響，在250 mL的具塞錐形瓶中都能平鋪于瓶底，堆積厚度較小，降低了超聲波的衰減;二是使試劑對樣品內(nèi)部的浸提作用更充分;三是當(dāng)藥材用量較小時，可以在一定程度上忽略雜質(zhì)干擾。

［1］黃文哲，柳 燕，秦民堅(jiān)，等.太子參提取物對小鼠免疫功能的影響［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2005，19(6):35－37.

［2］熊何鍵，龐 杰，謝主興.太子參提取物體外抗氧化活性研究［J］.南開大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2009，42(6):37－40.

［3］劉訓(xùn)紅，談獻(xiàn)和，曾艷萍，等.不同產(chǎn)地太子參的質(zhì)量比較［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2007，22(2):36－38.

［4］許漢英，梁 春，周 曉，等.超聲波微量提取快速測定人參總皂苷［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2004，23(7):51－53.

［5］王 俊.分光光度法測定薯蕷皂苷元［J］.分析實(shí)驗(yàn)室，2004，23(1):73－75.

［6］葉碧莎.人參沖劑中人參總皂苷的含量測定［J］.廣西預(yù)防醫(yī)學(xué)，1998，4(1):28－30.

［7］彭愛紅，熊何健，顏宇航.太子參總皂苷的含量測定方法研究［J］.四川師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2006，29(6):743－746.

［8］陳戰(zhàn)國，耿 征，劉謙光，等.薯蕷皂甙元的分光光度法測定［J］.分析化學(xué)，1996，24(2):227－229.

［9］閏 亮，秦民堅(jiān)，賀定翔，等.太子參多糖及皂苷的積累動態(tài)研究［J］.現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2005，19(6):10－13.