榮 瓊， 朱雙喜， 陳松齡△， 李 祥， 黃代營， 張 興

(1中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510080； 2廣東省中醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510120)

側(cè)壁開窗法上頜竇底提升術(shù)植入Bio-Oss后骨生成的mRNA表達譜*

榮 瓊1， 朱雙喜1， 陳松齡1△， 李 祥1， 黃代營1， 張 興2

(1中山大學(xué)第一附屬醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510080；2廣東省中醫(yī)院口腔科，廣東 廣州 510120)

目的探討側(cè)壁開窗法上頜竇底提升術(shù)這種特殊的引導(dǎo)性骨再生(guided bone regeneration, GBR)過程的轉(zhuǎn)錄組特點。方法3只Beagle犬，隨機選擇一側(cè)經(jīng)側(cè)壁開窗行上頜竇底提升術(shù)，同時植入Bio-Oss骨粉，術(shù)后2周，對另一側(cè)用相同的方法行上頜竇底提升術(shù)。第2次術(shù)后2周，收集植入的Bio-Oss骨粉組織塊，提取總RNA，全基因組表達譜芯片檢測分析上頜竇底提升后2周和4周時的差異表達基因。利用基因本體論(gene ontology, GO)對差異表達的基因進行功能分類，以及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)進行信號通路分析。結(jié)果在2周時表達升高的基因與刺激反應(yīng)、免疫-炎癥反應(yīng)和細胞增殖有關(guān)，同時，與神經(jīng)元分化、破骨細胞分化和早期血管化過程相關(guān)的基因也高表達。在4周時，與細胞代謝和發(fā)育相關(guān)的基因表達升高，重要的是，與血管生成和骨骼發(fā)育相關(guān)的基因都高表達，與骨骼發(fā)育相關(guān)的基因包括骨生成相關(guān)的生長和分化因子[轉(zhuǎn)化生成因子β1(transforming growth factor beta 1, TGFB1)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein 4, BMP4)]、軟骨和骨胞外基質(zhì)[軟骨黏附素(chondroadherin, CHAD)、Ⅰ型膠原α1鏈(collagen type I, alpha 1 chain, COL1A1)、Ⅰ型膠原α2鏈(collagen type I, alpha 2 chain, COL1A2)、Ⅴ型膠原α2鏈(collagen type Ⅴ, alpha 2 chain, COL5A2)、核心蛋白聚糖(decorin, DCN)、骨連接蛋白(osteonectin, SPARC)和骨鈣素(osteocalcin, BGLAP)]等相關(guān)的基因。信號通路分析顯示4周時表達升高的基因與轉(zhuǎn)化生長因子β/骨形態(tài)發(fā)生蛋白(transforming growth factor beta/bone morphogenetic protein, TGF-β/BMP)信號通路有關(guān)。無翅型MMTV整合位點家族(wingless-type MMTV integration site family, WNT)信號通路中的關(guān)鍵基因WNT5A和卷曲蛋白受體9(frizzled receptor 9, FZD9)在2周時表達升高，而連環(huán)蛋白β1(catenin beta 1, CTNNB1)在4周時表達升高。結(jié)論側(cè)壁開窗法上頜竇底提升術(shù)2周后轉(zhuǎn)錄表達譜變化以免疫-炎癥反應(yīng)和破骨反應(yīng)下調(diào)、骨生成相關(guān)基因表達升高為特點，骨再生的過程還與神經(jīng)生成和血管生成過程相關(guān)。在骨再生的過程中，TGF-β/BMP和WNT信號通路起重要作用，WNT信號通路的作用復(fù)雜。

上頜竇底提升； 引導(dǎo)骨組織再生； 成骨； 轉(zhuǎn)錄組； TGF-β/BMP信號通路

側(cè)壁開窗法上頜竇底提升術(shù)(maxillary sinus floor elevation by lateral window approach)可顯著增加上頜竇底剩余牙槽骨的高度，為上頜后牙區(qū)牙種植創(chuàng)造條件。該手術(shù)通過骨移植材料支撐分離的上頜竇底黏膜和下方骨壁產(chǎn)生的空間，頰側(cè)開窗部位由復(fù)位的骨塊和/或屏障膜覆蓋，使骨移植材料位于密閉穩(wěn)定的空間，保證骨原細胞從下方牙槽骨或上方黏膜中遷移、分化[1-2]，在骨移植材料內(nèi)逐漸成骨，這是引導(dǎo)性骨再生(guided bone regeneration, GBR)的過程[3]。Bio-Oss是由牛骨經(jīng)脫蛋白等特殊處理后得到的一種碳酸鹽磷灰石晶體，在理化性能上與人骨非常相似，具有良好的生物相容性和骨引導(dǎo)能力，在人體內(nèi)吸收速率慢，已成為最常用的上頜竇底提升骨移植材料[4]。側(cè)壁開窗法上頜竇底提升術(shù)后骨再生和重建需3～6個月，才能植入種植體，等待時間太久，因此了解竇底提升后引導(dǎo)骨組織再生的細胞和分子機制，可以為尋找加速骨組織再生的方法提供依據(jù)。

已有研究用芯片技術(shù)檢測長骨骨折[5]和顱骨臨界性缺損(critical-size defect, CSD)GBR[6]時的轉(zhuǎn)錄表達譜，發(fā)現(xiàn)骨愈合的過程非常復(fù)雜，涉及多種多樣的生物學(xué)過程及信號通路，并且骨組織的再生與血管和神經(jīng)的再生密切相關(guān)。但是，長骨骨折的愈合是軟骨內(nèi)成骨，而顱頜面骨生成以膜內(nèi)成骨為特點，而且，長骨骨折愈合和顱骨臨界性缺損GBR都是在新鮮骨創(chuàng)周圍成骨，與上頜竇底提升新骨形成明顯不同。上頜竇底提升沒有骨創(chuàng)面，新骨形成位于皮質(zhì)骨外側(cè)[1]，成骨時間遠遠長于長骨骨折和顱骨臨界性缺損GBR的愈合期限，因此，上頜竇底提升是一種特殊的GBR，研究其成骨的生物學(xué)機制有非常重要的意義。

本研究將采用全基因組芯片檢測比較犬側(cè)壁開窗法上頜竇底提升后2周和4周時的mRNA表達譜，了解這種特殊的GBR早期成骨的分子學(xué)過程，同時，期待發(fā)現(xiàn)一些與成骨密切相關(guān)的重要基因，為進一步研究在臨床上促進上頜竇底提升成骨提供分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

材 料 和 方 法

1動物

健康的1～2周歲Beagle犬，購于高要市康達實驗動物科技有限公司，許可證號為SCXK(粵)2009-6679。

2試劑

速眠寧Ⅱ購自吉林省華牧動物保健品有限公司，戊巴比妥鈉購自Sigma，Bio-Oss骨粉購自Geistlich，TRIzol購自Invitrogen，RNasey Mini Kit購自Qiagen，Baseline-ZERO DNase購自Epicenter，Quick Amp Labeling Kit、Agilent Gene Expression Hybridization Kit和Gene Expression Wash Buffer購自Agilent。

3方法

3.1側(cè)壁開窗法上頜竇底提升術(shù) 速眠寧Ⅱ0.08 mL/kg肌注，待Beagle犬安靜入睡后，按戊巴比妥鈉25 mg/kg進行腹腔注射。常規(guī)消毒鋪巾。隨機選擇一側(cè)上頜沿上頜第3前磨牙近中和第4前磨牙遠中做垂直切口達前庭溝，翻開黏骨膜瓣，暴露眶下神經(jīng)管外側(cè)骨壁，鑿開骨質(zhì)，分離，結(jié)扎并切斷去除眶下神經(jīng)血管束。在眶下神經(jīng)管內(nèi)側(cè)，即上頜竇頰側(cè)設(shè)計大小約20 mm×8 mm的骨窗邊界，沿界線鑿開骨板形成骨窗，小心剝離上頜竇底黏膜，生理鹽水沖洗，提升竇底黏膜約10 mm，植入Bio-Oss骨粉。然后復(fù)位上頜竇頰側(cè)骨板，覆蓋黏骨膜瓣，縫合。術(shù)后單獨飼養(yǎng)，予半流飲食、慶大霉素(80 mg/d)肌注3 d，之后常規(guī)飼養(yǎng)。術(shù)后2周，另一側(cè)同法行上頜竇底提升。

3.2樣本準(zhǔn)備 第2次手術(shù)后2周全麻下放血處死Beagle犬，小心分離新生組織包裹的Bio-Oss骨粉，生理鹽水輕輕漂洗后，沿竇底提升方向剪取1/3組織，置于1.5 mL無酶EP管中，加入1 mL TRIzol，液氮中保存。樣本遂分為2組，即上頜竇底提升2周組和上頜竇底提升4周組，各組3個樣本。

3.3樣本總RNA的提取及質(zhì)檢 取約100 mg組織，用BiopulverizerTM生物粉碎機冰凍粉碎組織，加入1 mL的總RNA抽提試劑TRIzol，用Mini-Bead-Bea-ter-16抽提總RNA，按照廠家產(chǎn)品說明書用RNasey Mini Kit純化總RNA。再用NanoDrop ND-1000檢測RNA在260 nm、280 nm和230 nm的吸收值，計算RNA濃度及評估其純度，變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的純度及完整性。

3.4RNA標(biāo)記及芯片雜交 依靠Agilent 服務(wù)平臺行犬全基因組表達譜分析，芯片版本為Agilent Canine 4×44K Gene Expression Microarrays V2，含43 803個探針?；緳z測過程為，1 μg總RNA用Quick Amp Labeling Kit, One-Color逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，擴增后轉(zhuǎn)錄為cRNA，并用Cy3-UTP標(biāo)記。標(biāo)記的cRNAs用RNasey Mini Kit純化后，NanoDrop ND-1000檢測cRNA和Cy3濃度，計算Cy3特異性活性，cRNA總量≥1.65 μg且Cy3特異性活性≥9.0 μmol/g的cRNA可進行后續(xù)雜交。用Agilent Gene Expression Hybridization Kit將標(biāo)記好的cRNA斷裂，在標(biāo)準(zhǔn)條件下與表達譜芯片雜交，洗脫后，Agilent Microarray Scanner掃描圖像。

3.5數(shù)據(jù)處理及分析 Agilent Feature Extraction 11.0.1.1將掃描圖像上各點的熒光強度轉(zhuǎn)化為原始數(shù)據(jù)，用GeneSpring GX 11.5.1軟件包對原始數(shù)據(jù)行分位數(shù)標(biāo)準(zhǔn)化，除去低表達的基因，然后進行統(tǒng)計學(xué)分析，篩選出2周和4周比較時改變倍數(shù)在3倍以上的差異表達基因，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對有統(tǒng)計學(xué)差異的基因采用標(biāo)準(zhǔn)富集計算法進行基因本體論(gene ontology, GO)分析及京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG)通路分析。

結(jié) 果

與2周時相比，4周時表達降低的基因有514個，參與生物學(xué)過程(biological process, BP)的GO條目有363條，參與細胞組分(cellular component, CC)的GO條目有31條，參與分子功能(molecular function, MF)的GO條目有46條；4周時表達升高的基因是1 069個，參與BP的GO條目有657條，參與CC的GO條目有172條，參與MF的GO條目有147條。

12周時上調(diào)的GO分類

2周時，新長入Bio-Oss骨粉中的組織高表達的基因(即4周時表達降低的基因)所屬的關(guān)鍵GO分類見表1。在BP中，與刺激反應(yīng)和免疫-炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因高表達，與細胞增殖和凋亡有關(guān)的基因也高表達，同時，可以發(fā)現(xiàn)與神經(jīng)元分化和破骨細胞分化相關(guān)的基因高表達，早期血管化過程相關(guān)的基因也高表達，G蛋白偶聯(lián)受體信號通路和絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)級聯(lián)反應(yīng)相關(guān)基因表達升高。在CC中，與細胞周緣、胞漿膜和胞外區(qū)域相關(guān)的基因高表達。在MF中，與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活性有關(guān)的基因高表達。

與破骨過程相關(guān)的基因見表2，上調(diào)的基因為連接斑蛋白(junction plakoglobin, JUP)、G蛋白偶聯(lián)受體55(G-protein-coupled receptor 55, GPR55)、趨化因子C-C模序配體5(chemokine C-C motif ligand 5, CCL5)、 CCL3、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)、CD38、黑皮質(zhì)素4受體(melanocortin 4 receptor, MC4R)和組織蛋白酶S(cathepsin S, CTSS)。

表12周時表達升高基因所屬的功能相關(guān)的上調(diào)GO分類

Table 1. Up-regulated genes whose functionally relevant gene ontology (GO) terms were over-represented (P<0.05) at 2 weeks

GOIDTermCountBiologicalprocessGO:0050896Responsetostimulus268GO:0006950Responsetostress102GO:0009611Responsetowounding40GO:0006952Defenseresponse39GO:0006955Immuneresponse32GO:0002376Immunesystemprocess65GO:0045321Leukocyteactivation26GO:0006954Inflammatoryresponse23GO:0002526Acuteinflammatoryresponse9GO:0050729Positiveregulationofinflammatoryresponse6GO:0008283Cellproliferation58GO:0006915Apoptoticprocess57GO:0000902Cellmorphogenesis43GO:0048812Neuronprojectionmorphogenesis30GO:0048667Cellmorphogenesisinvolvedinneurondifferentiation29GO:0007409Axonogenesis26GO:0021675Nervedevelopment8GO:0003018Vascularprocessincirculatorysystem13GO:0045670Regulationofosteoclastdifferentiation5GO:0045453Boneresorption5GO:0030316Osteoclastdifferentiation5GO:0007186G-protein-coupledreceptorsignalingpathway59GO:0000165MAPKcascade18CellularcomponentGO:0071944Cellperiphery112GO:0005886Plasmamembrane109GO:0005576Extracellularregion63MolecularfunctionGO:0004871Signaltransduceractivity70

24周時上調(diào)的GO分類

與2周時相比，4周時新長入Bio-Oss骨粉中的組織高表達基因所屬的關(guān)鍵GO分類見表3。在BP中，與細胞代謝(蛋白質(zhì)、核酸和RNA代謝)過程、生長和發(fā)育(細胞、組織、器官和系統(tǒng))相關(guān)的基因表達升高，其中，與血管生成和骨骼發(fā)育相關(guān)的基因都高表達，同時，與應(yīng)激反應(yīng)、細胞周期和凋亡相關(guān)的基因也高表達，I-κB激酶/NF-κB級聯(lián)反應(yīng)和ER-核信號通路相關(guān)基因表達升高。在CC中，胞內(nèi)組分(包括細胞質(zhì)、細胞核、線粒體、核糖體、高爾基體等)和細胞外基質(zhì)相關(guān)的基因都高表達。在MF中，與結(jié)合(包括蛋白、核酸、RNA、ATP、輔酶、轉(zhuǎn)錄因子等)和催化活性(包括水解酶、ATP酶、核糖核酸酶等)相關(guān)的基因高表達，重要的是，與生長因子，特別是胰島素樣生長因子和血小板源性生長因子結(jié)合基因表達都升高。

4周比2周表達升高的、與成骨過程直接相關(guān)的基因見表4。GO分類涉及軟骨發(fā)育、軟骨內(nèi)骨形態(tài)發(fā)生、骨小梁形成、骨骼系統(tǒng)發(fā)育、調(diào)節(jié)骨化、骨改建、成骨細胞分化以及胞外結(jié)構(gòu)形成等生物學(xué)過程。另外，胰島素樣生長因子和血小板源性生長因子及其結(jié)合相關(guān)的基因，如胰島素樣生長因子2(insulin-like growth factor 2, IGF2)(4.07倍)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白4(insulin-like growth factor binding protein 4, IGFBP4)(19.90倍)、胰島素樣生長因子2受體(insulin-like growth factor 2 receptor, IGF2R)(8.79倍)、胰島素樣生長因子結(jié)合蛋白7(insulin-like growth factor binding protein 7, IGFBP7)(4.31倍)和血小板源性生長因子D(platelet-derived growth factor D, PDGFD)(16.99倍)的表達都顯著升高。

表2 2周時表達升高的與骨吸收過程相關(guān)的基因

表34周時表達升高基因所屬的功能相關(guān)的上調(diào)GO分類

Table 3. Up-regulated genes whose functionally relevant gene ontology (GO) terms were over-represented (P<0.05) at 4 weeks

GOIDTermCountBiologicalprocessGO:0044237Cellularmetabolicprocess654GO:0044267Cellularproteinmetabolicprocess282GO:0090304Nucleicacidmetabolicprocess255GO:0016070RNAmetabolicprocess207GO:0040007Growth191GO:0032502Developmentalprocess538GO:0048856Anatomicalstructuredevelopment428GO:0048731Systemdevelopment362GO:0048513Organdevelopment280GO:0048468Celldevelopment149GO:0009888Tissuedevelopment147GO:0001568Bloodvesseldevelopment51GO:0001944Vasculaturedevelopment51GO:0001525Angiogenesis32GO:0001501Skeletalsystemdevelopment41GO:0051216Cartilagedevelopment27GO:0030278Regulationofossification16GO:0001649Osteoblastdifferentiation13GO:0046849Boneremodeling9GO:0045669Positiveregulationofosteoblastdifferentiation7GO:0060343Trabeculaformation5GO:0061383Trabeculamorphogenesis5GO:0060350Endochondralbonemorphogenesis5GO:0032964Collagenbiosyntheticprocess4GO:0006950Responsetostress217GO:0007049Cellcycle124GO:0006915Apoptoticprocess124GO:0007249I-κBkinase/NF-κBcascade19GO:0006984ER-nucleussignalingpathway8CellularcomponentGO:0071944Intracellularpart935GO:0031012Extracellularmatrix31MolecularfunctionGO:0005488Binding989GO:0019838Growthfactorbinding17GO:0005520Insulin-likegrowthfactorbinding6GO:0048407Platelet-derivedgrowthfactorbinding4GO:0003824Catalyticactivity465

3成骨通路分析

對與成骨過程直接密切相關(guān)的轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta, TGF-β)信號通路分析發(fā)現(xiàn)，2周時表達升高的基因有2個在TGF-β信號通路中，是TNF(4.75倍)和蛋白質(zhì)磷酸酶2調(diào)節(jié)亞基A α亞型(protein phosphatase 2, regulatory subunit A, alpha isoform, PPP2R1A)(3.04倍)。4周時表達升高的基因有13個出現(xiàn)在TGF-β信號通路中，見表5，在通路表中的標(biāo)記見圖1。

對與成骨過程密切相關(guān)的另一信號通路無翅型MMTV整合位點家族(wingless-type MMTV integration site family, WNT)分析發(fā)現(xiàn)，2周時表達升高的基因，5個出現(xiàn)在WNT信號通路中，分別是WNT5A(4.44倍)、卷曲蛋白受體9(frizzled receptor 9, FZD9)(4.47倍)、FOS樣抗原1(FOS-like antigen 1, FOSL1)(3.08倍)、PPP2R1A(3.04倍)和蛋白激酶C β型(protein kinase C, beta type, PPKCB)(8.33倍)。4周時，14個表達升高的基因包含在WNT信號通路中，見表6，值得注意的是，沒有觀察到通路起始的關(guān)鍵基因WNT、低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(low-density lipoprotein receptor-related protein, LRP)、FZD等的表達。其中，WNT/β-catenin通路中表達升高的基因是分泌型卷曲相關(guān)蛋白4(secreted frizzled-related protein 4, SFRP4)、連環(huán)蛋白β1(catenin beta 1, CTNNB1)、酪蛋白激酶2 β多肽(casein kinase 2, beta polypeptide, CSNK2B)、蛋白磷酸酶2催化亞基α亞型(protein phosphatase 2, catalytic subunit, alpha isoform, PPP2CA)、蛋白磷酸酶2催化亞基β亞型(protein phosphatase 2, catalytic subunit, beta isoform, PPP2CB)、酪蛋白激酶1 α1(casein kinase 1, alpha 1, CSNK1A1)、CREB結(jié)合蛋白(CREB binding protein, CREBBP)、jun原癌基因(junproto-oncogene, JUN)和v-myc髓細胞組織增生病毒原癌基因同源物(v-mycmyelocytomatosis viral oncogene homolog, MYC)；WNT/平面細胞極化(planar cell polarity, PCP)通路中表達升高的基因是磷脂酰肌醇蛋白聚糖4(glypican 4, GPC4)、ras同源基因家族成員A(rashomolog gene family, member A, RHOA)和ras相關(guān)C3肉毒素底物1(ras-related C3 botulinum toxin substrate 1, RAC1)；WNT/Ca2+通路中則包含蛋白磷酸酶3催化亞基β亞型(protein phosphatase 3, catalytic subunit, beta isoform, PPP3CB)和鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶2δ(calcium/calmodulin-dependent protein kinase II delta, CAMK2D)這2個基因。

表4 4周時表達升高的與骨形成過程相關(guān)的基因

ENPP1Ectonucleotidepyrophosphatase/phosphodiesterase1RegulationofossificationBoneremodeling6.25PDLIM5PDZandLIMdomain5Positiveregulationofosteoblastdifferentiation3.35GPNMBGlycoprotein(transmembrane)NMBOsteoblastdifferentiation3.54CTSKCathepsinKBoneremodeling28.96CA2CarbonicanhydraseIIBoneremodeling6.78IL6Interleukin6Boneremodeling4.58CALCRLCalcitoninreceptor-likeBoneremodeling3.74COL1A2CollagentypeI,alpha2chainCartilagedevelopmentExtracellularstructureorganizationResponsetogrowthfactorstimulus11.62COL5A2CollagentypeV,alpha2chainCartilagedevelopmentResponsetogrowthfactorstimulusSkeletalsystemdevelopmentRegulationofossification4.77COL3A1CollagentypeⅢ,alpha1chainCartilagedevelopmentExtracellularstructureorganizationResponsetogrowthfactorstimulusSkeletalsystemdevelopmentRegulationofossification3.81COL1A1CollagentypeI,alpha1chainCartilagedevelopmentExtracellularstructureorganizationTrabeculaformationSkeletalsystemdevelopmentOsteoblastdifferentiationEndochondralbonemorphogenesis3.72COL5A1CollagentypeV,alpha1chainCartilagedevelopmentExtracellularstructureorganizationSkeletalsystemdevelopment3.43

討 論

本研究采用全基因組芯片研究側(cè)壁開窗法上頜竇底提升術(shù)后mRNA表達譜的情況。側(cè)壁開窗法上頜竇底提升術(shù)是一種典型的GBR手術(shù)[2]，復(fù)位的頰側(cè)骨壁和/或屏障膜阻擋外部軟組織來源的細胞長入提升的密閉的上頜竇底空間，保證新生骨組織緩慢形成。現(xiàn)在，大多數(shù)學(xué)者都是用臨界性骨缺損模型研究GBR的生物學(xué)過程[6-8]，這種骨缺損模型是新鮮制作的，創(chuàng)面血凝塊充足，含有大量的生長因子，如血小板源性生長因子、血管生成素、轉(zhuǎn)化生長因子β、胰島素樣生長因子、血管內(nèi)皮生長因子、堿性成纖維細胞生長因子等，它們在骨再生的過程中都有促進作用。并且，臨界性骨缺損新骨形成是位于缺損區(qū)內(nèi)。這些與側(cè)壁開窗法上頜竇底提升的GBR情況差異較大，側(cè)壁開窗法上頜竇底提升只在側(cè)壁骨窗有少量的新鮮骨創(chuàng)面，后期新骨的形成是位于原皮質(zhì)骨的外側(cè)。所以，在成骨過程和成骨機制上都會有所差別，全基因組表達譜芯片檢測可以全面地了解這種特殊的GBR的成骨機制。

本研究通過比較2周和4周時mRNA的表達譜，篩選差異表達的基因以便了解側(cè)壁開窗法上頜竇底提升早期成骨過程中細胞和分子發(fā)生的改變。研究結(jié)果顯示2周和4周之間是早期成骨的關(guān)鍵過程，這表明實驗設(shè)計時點的選擇是合理的。

2周時，有514個基因表達升高，與之相關(guān)的GO條目有440個，主要是與刺激反應(yīng)、免疫-炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因高表達。而4周時，有1 069個基因高表達，與之相關(guān)的GO條目有657個，主要是與細胞代謝和生長發(fā)育相關(guān)的基因高表達。顯然，4周時的生物學(xué)過程更精細復(fù)雜，直接影響骨組織的再生。Ivanovski等[6]比較Wistar大鼠顱骨臨界性骨缺損GBR術(shù)后7 d和14 d的新生組織mRNA轉(zhuǎn)錄表達譜發(fā)現(xiàn)7 d時表達升高的基因與早期創(chuàng)傷愈合相關(guān)，包含免疫-炎癥反應(yīng)，14 d時隨之升高的基因與骨再生過程相關(guān)。Rundle等[9]研究大鼠腓骨骨折愈合3 d和11 d時的基因表達譜發(fā)現(xiàn)3 d時炎癥反應(yīng)的基因高表達，11 d時與骨化有關(guān)的基因高表達。本研究結(jié)果與Ivanovski等[6]和Rundle等[9]的研究結(jié)果呈現(xiàn)了相似的生理學(xué)過程，即早期為免疫-炎癥反應(yīng)，之后才有骨組織再生。免疫-炎癥反應(yīng)在骨生成過程中的確切作用并不十分清楚，但是炎癥是骨折愈合、骨生成關(guān)鍵的第一步，避免炎癥反應(yīng)時間過長、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)可促進骨愈合[10]。

Figure 1. Mapping of gene members of the “TGF-β signaling pathway” up-regulated at 4 weeks. Yellow marked nodes are associated with up-regulated genes, while green nodes have no significance.

圖14周時表達升高的基因在“TGF-β信號通路”中的標(biāo)記

表5 4周時表達升高的屬“TGF-β信號通路”的基因

表6 4周時表達升高的屬“WNT信號通路”的基因

在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)2周時，除了與刺激反應(yīng)、免疫-炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因表達升高外，與破骨細胞分化、骨吸收相關(guān)的基因表達明顯升高，而在骨折愈合和臨界性骨缺損GBR愈合的早期都未發(fā)現(xiàn)與破骨反應(yīng)相關(guān)的基因差異性高表達[6,9]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)上頜竇底提升Bio-Oss植入后6月以上仍能在Bio-Oss顆粒周圍觀察到破骨樣細胞，與骨吸收相關(guān)的蛋白水解酶基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteina, MMP)2、MMP9和MMP13高表達[11-12]。同時，上頜竇底提升新骨生成過程中，首先需要下方皮質(zhì)骨吸收，骨髓腔暴露，骨原細胞才可從下方牙槽骨遷移至表面分化成骨[13-14]。本研究結(jié)果提示與骨折愈合和臨界性骨缺損GBR愈合不同，上頜竇底提升術(shù)早期除了刺激反應(yīng)、免疫-炎癥反應(yīng)外，同時存在明顯的破骨反應(yīng)現(xiàn)象，與破骨細胞分化、骨吸收相關(guān)基因的高表達可能跟骨移植材料Bio-Oss植入后吸收和周圍骨皮質(zhì)吸收有關(guān)。

2周時，在與破骨細胞分化、骨吸收相關(guān)的基因表達升高的同時，與神經(jīng)元分化相關(guān)的基因也高表達。然而，神經(jīng)元分化在骨再生中的確切作用仍不清楚。近年來，有研究顯示破骨前體細胞和成骨前體細胞表達P物質(zhì)受體NK1，感覺神經(jīng)元釋放神經(jīng)遞質(zhì)P物質(zhì)可刺激破骨細胞和成骨細胞的分化，調(diào)節(jié)局部骨的轉(zhuǎn)化[15]?？梢酝茰y，本研究上頜竇底提升術(shù)中與神經(jīng)元分化相關(guān)的基因表達升高可能與破骨細胞分化和骨吸收相關(guān)，最終促進骨的生成。

成骨相關(guān)基因在4周時表達明顯升高，GO分類中包括軟骨發(fā)育、軟骨內(nèi)骨形態(tài)發(fā)生、骨小梁形成、骨骼系統(tǒng)發(fā)育、調(diào)節(jié)骨化、骨改建、成骨細胞分化以及胞外結(jié)構(gòu)形成等生物學(xué)過程，以及胰島素樣生長因子結(jié)合、血小板源性生長因子結(jié)合等分子功能。與軟骨胞外基質(zhì)[軟骨黏附素(chondroadherin, CHAD)]和骨胞外基質(zhì)[Ⅰ型膠原α1鏈(collagen type I, alpha 1 chain, COL1A1)、Ⅰ型膠原α2鏈(collagen type I, alpha 2 chain, COL1A2)、Ⅴ型膠原α2鏈(collagen type Ⅴ, alpha 2 chain, COL5A2)、核心蛋白聚糖(decorin, DCN)、骨連接蛋白(osteonectin, SPARC)和骨鈣素(osteocalcin, BGLAP)]、促進骨生成的生長和分化因子[轉(zhuǎn)化生成因子β1(tranforming growth factor beta 1, TGFB1)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bone morphogenetic protein 4, BMP4)]有關(guān)的基因表達在4周時升高，其中CHAD(18.02倍)、TGFB1(17.00倍)、COL1A2(11.62倍)和SPARC(10.81倍)升高顯著，表明2周和4周間成骨過程活躍。雖然顱頜面骨生成是以膜內(nèi)成骨為特點，但經(jīng)GO分析發(fā)現(xiàn)在側(cè)壁開窗法上頜竇底提升Bio-Oss骨粉植入后4周新骨生成有軟骨內(nèi)成骨現(xiàn)象的發(fā)生，其明顯的依據(jù)是上述的軟骨特異性胞外基質(zhì)(CHAD)表達升高了18.02倍。有研究顯示，不同的骨移植材料所激活的骨再生信號通路也有所不同，如與成骨樣細胞共培養(yǎng)時，生物活性玻璃PerioGlas激活骨形成信號通路，Bio-Oss還可激活軟骨形成相關(guān)通路[16]。顯然，盡管先天性胚胎發(fā)育時機體控制各種細胞包括骨細胞分化和生長的很多分子機制，在骨再生時這些機制會重新發(fā)生，但是骨再生過程中這些機制也可能受后天某些局部環(huán)境的影響，從而與胚胎發(fā)育時不同[17]。上頜竇底提升后新骨生成的過程中同時存在軟骨內(nèi)成骨的機制可能與手術(shù)方式、骨移植材料等局部環(huán)境的影響有關(guān)。

血管生成對骨形成至關(guān)重要，血管不僅為新骨生成輸送氧和營養(yǎng)物質(zhì)，還是骨改建和修復(fù)前體細胞的重要來源[18]。上頜竇底提升2周時便發(fā)現(xiàn)與血管化過程相關(guān)的13個基因表達升高，4周時，更多(51個)與血管發(fā)育相關(guān)的基因表達升高。在上頜竇底提升4周時發(fā)現(xiàn)缺氧誘導(dǎo)因子1 α亞基(hypoxia inducible factor 1, alpha subunit, HIF1A)表達較2周時升高15.34倍，成骨微環(huán)境中低氧可以誘導(dǎo)成骨細胞的成熟[19]，在HIFs的刺激下，成熟的成骨細胞可分泌大量的血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)，VEGF直接作用于成骨細胞表面受體誘導(dǎo)骨生成，除此之外，VEGF還可作用于內(nèi)皮細胞誘導(dǎo)血管生成，增加對多能干細胞或成骨前體細胞、成骨生長因子及營養(yǎng)的供應(yīng)，間接促進骨生成[20]。

TGF-β/BMP和WNT信號級聯(lián)反應(yīng)可以刺激骨原細胞增殖和分化，促進骨形成，本研究同時對2周和4周表達升高的基因利用KEGG網(wǎng)站對與成骨過程密切相關(guān)的TGF-β和WNT信號通路進行標(biāo)記。發(fā)現(xiàn)在TGF-β信號通路中，2周時TNF和PPP2R1A表達升高，但這2個基因都不是在TGF-β信號通路中特異性表達，明顯地，TGF-β信號通路在2周時對新骨形成的作用不突出。相反，4周時，與TGF-β信號通路相關(guān)的13個基因表達升高，包括關(guān)鍵的TGFB1、BMP4和Smad家族成員5(Smad family member 5, SMAD5)等，顯然，TGF-β/BMP信號通路與4周時骨生成有關(guān)。對WNT信號通路分析發(fā)現(xiàn)，特異性的WNT5A(4.44倍)和FZD9(4.47倍)在2周時表達升高，而CTNNB1(8.07倍)在4周時表達升高，推測WNT/β-catenin信號通路在2周至4周骨吸收至骨生成階段的表達可能還有其它通路的介入，使WNT與β-catenin的改變并不同步，但WNT信號通路在竇底提升成骨過程中的作用是肯定的。本實驗研究結(jié)果表明TGF-β/BMP和WNT信號通路是上頜竇提升成骨過程中的2條主要信號通路，此前Ivanovski等[6]和Rundle等[9]的實驗也發(fā)現(xiàn)與TGF-β/BMP和WNT信號通路有關(guān)的基因在成骨過程中表達升高，說明這2條信號通路在其它部位的成骨反應(yīng)中同樣起到極其重要的作用。

雖然我們利用全基因組表達譜芯片檢測技術(shù)對側(cè)壁開窗法上頜竇底提升這種特殊的GBR成骨的分子機制有了全面的認識，并發(fā)現(xiàn)早期影響成骨的一些關(guān)鍵的基因，但是很難全面了解這一過程不同時間、不同部位的基因表達情況，因為成骨相關(guān)基因隨時間延續(xù)表達一直在改變，2周和4周基因表達的改變不足以代表整個成骨過程，而且，上頜竇底提升后新骨在Bio-Oss內(nèi)的生長是從周圍向中間逐漸進行的，每個部位的成骨過程不一樣，基因表達譜的情況也不一樣。因此，還需要對更多時點進行檢測，對與骨再生關(guān)鍵基因相關(guān)的蛋白進行原位雜交和免疫組化檢測以定位它們的表達，才能對它們的作用有更深入的認識。

本研究首次認識了側(cè)壁開窗法上頜竇底提升骨生成的轉(zhuǎn)錄機制，有助于全面了解這種特殊的GBR的生物學(xué)過程和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。我們發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)、骨吸收、神經(jīng)生成和血管生成都與骨再生密切相關(guān)，其確切作用需要更深入的研究。TGF-β/BMP和WNT信號通路在竇底提升成骨中起重要作用，這2條信號通路中的TGFB1、BMP4、SMAD5和CTNNB1與成骨密切相關(guān)。已有研究顯示，上頜竇底提升后若能通過轉(zhuǎn)染細胞或生物材料攜帶方式加入某些成骨促進因子后，可促進新骨生成和成熟[21-23]。本研究除了能有助于理解側(cè)壁開窗法上頜竇底提升骨生成的基本細胞和分子機制外，我們推測這些與成骨密切相關(guān)的基因還可為促進骨生成提供潛在的調(diào)控靶點。

[1] Lundgren S, Andersson S, Gualini F, et al. Bone reformation with sinus membrane elevation: a new surgical technique for maxillary sinus floor augmentation[J]. Clin Implant Dent Relat Res, 2004, 6(3):165-173.

[2] Cricchio G, Palma VC, Faria PE, et al. Histological findings following the use of a space-making device for bone reformation and implant integration in the maxillary sinus of primates[J]. Clin Implant Dent Relat Res, 2009, 11 (Suppl 1):e14-e22.

[3] Buser D, Dula K, Belser U, et al. Localized ridge augmentation using guided bone regeneration. 1. Surgical procedure in the maxilla[J]. Int J Periodontics Restorative Dent, 1993, 13(1):29-45.

[4] Piattelli M, Favero GA, Scarano A, et al. Bone reactions to anorganic bovine bone (Bio-Oss) used in sinus augmentation procedures: a histologic long-term report of 20 cases in humans[J]. Int J Oral Maxillofac Implants, 1999, 14(6):835-840.

[5] Bais M, McLean J, Sebastiani P, et al. Transcriptional analysis of fracture healing and the induction of embryonic stem cell-related genes[J]. PLoS One, 2009, 4 (5):e5393.

[6] Ivanovski S, Hamlet S, Retzepi M, et al. Transcriptional profiling of “guided bone regeneration” in a critical-size calvarial defect[J]. Clin Oral Implants Res, 2011, 22 (4):382-389.

[7] Donos N, Graziani F, Mardas N, et al. The use of human hypertrophic chondrocytes-derived extracellular matrix for the treatment of critical-size calvarial defects[J]. Clin Oral Implants Res, 2011, 22 (12):1346-1353.

[8] Miyahara T, Nyan M, Shimoda A, et al. Exploitation of a novel polysaccharide nanogel cross-linking membrane for guided bone regeneration (GBR)[J]. J Tissue Eng Regen Med, 2012, 6(8):666-672.

[9] Rundle CH, Wang H, Yu H, et al. Microarray analysis of gene expression during the inflammation and endochondral bone formation stages of rat femur fracture repair[J]. Bone, 2006, 38(4):521-529.

[10] Kolar P, Schmidt-Bleek K, Schell H, et al. The early fracture hematoma and its potential role in fracture healing[J]. Tissue Eng Part B Rev, 2010, 16(4):427-434.

[11] Bassil J, Senni K, Changotade S, et al. Expression of MMP-2, 9 and 13 in newly formed bone after sinus augmentation using inorganic bovine bone in human[J]. J Periodontal Res, 2011, 46(6):756-762.

[12] Chackartchi T, Iezzi G, Goldstein M, et al. Sinus floor augmentation using large (1-2 mm) or small (0.25-1 mm) bovine bone mineral particles: a prospective, intra-individual controlled clinical, micro-computerized tomography and histomorphometric study[J]. Clin Oral Implants Res, 2011, 22(5):473-480.

[13] Lundgren AK, Lundgren D, H?mmerle CH, et al. Influence of decortication of the donor bone on guided bone augmentation. An experimental study in the rabbit skull bone[J]. Clin Oral Implants Res, 2000, 11(2):99-106.

[14] Slotte C, Lundgren D. Impact of cortical perforations of contiguous donor bone in a guided bone augmentation procedure: an experimental study in the rabbit skull[J]. Clin Implant Dent Relat Res, 2002, 4(1):1-10.

[15] Wang L, Zhao R, Shi X, et al. Substance P stimulates bone marrow stromal cell osteogenic activity, osteoclast differentiation, and resorption activityinvitro[J]. Bone, 2009, 45(2):309-320.

[16] Annalisa P, Furio P, Ilaria Z, et al. Anorganic bovine bone and a silicate-based synthetic bone activate different microRNAs[J]. J Oral Sci, 2008, 50(3):301-307.

[17] Bahar H, Benayahu D, Yaffe A, et al. Molecular signaling in bone regeneration[J]. Crit Rev Eukaryot Gene Expr, 2007, 17(2):87-101.

[18] Sacchetti B, Funari A, Michienzi S, et al. Self-renewing osteoprogenitors in bone marrow sinusoids can organize a hematopoietic microenvironment[J]. Cell, 2007, 131 (2):324-336.

[19] 劉曉奇, 閆景龍. 低氧影響干細胞成骨分化的研究進展[J]. 中國病理生理雜志, 2011, 27(10):2027-2029.

[20] Mamalis AA, Cochran DL. The therapeutic potential of oxygen tension manipulation via hypoxia inducible factors and mimicking agents in guided bone regeneration. A review[J]. Arch Oral Biol, 2011, 56(12):1466-1475.

[21] Jiang XQ, Sun XJ, Lai HC, et al. Maxillary sinus floor elevation using a tissue-engineered bone complex with β-TCP and BMP-2 gene-modified bMSCs in rabbits[J]. Clin Oral Implants Res, 2009, 20(12):1333-1340.

[22] Gutwald R, Haberstroh J, Stricker A, et al. Influence of rhBMP-2 on bone formation and osseointegration in different implant systems after sinus-floor elevation. Aninvivostudy on sheep[J]. J Craniomaxillofac Surg, 2010, 38 (8):571-579.

[23] Zhang W, Wang X, Wang S, et al. The use of injectable sonication-induced silk hydrogel for VEGF165and BMP-2 delivery for elevation of the maxillary sinus floor[J]. Biomaterials, 2011, 32(35):9415-9424.

TranscriptionalprofilingofboneformationafterBio-Ossimplantationinmaxillarysinusfloorelevationbylateralwindowapproach

RONG Qiong1, ZHU Shuang-xi1, CHEN Song-ling1, LI Xiang1, HUANG Dai-ying1, ZHANG Xing2

(1DepartmentofStomatology,TheFirstAffiliatedHospital,SunYat-senUniversity,Guangzhou510080,China;2DepartmentofStomatology,GuangdongProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine,Guangzhou510120,China.E-mail:chensongling1@gmail.com)

AIM: To explore the characteristics of transcriptome associated with the unique guided bone regeneration (GBR) of maxillary sinus floor elevation by the lateral window approach.METHODSOne side of the upper jaw was randomly selected for maxillary sinus floor elevation with Bio-Oss by the lateral window approach in 3 Beagle dogs. The other side of maxillary sinus was elevated by the same approach 2 weeks later. Both Bio-Oss particles and ingrown tissues were harvested 2 weeks after the second operation. Total RNA was extracted and microarray analysis was carried out to identify the differences of the transcriptome at the 2nd and 4th weeks. Functional classification by gene ontology (GO) and signaling pathway analysis by Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) were applied to determine the differentially expressed genes.RESULTSThe genes up-regulated at the 2nd week were associated with stimulus response, immuno-inflammatory response and cell proliferation. Moreover, the genes related to neuron differentiation, osteoclast differentiation and early vascularization process were also up-regulated at this time point. At the 4th week, up-regulated genes were associated with cellular metabolism and development,importantly including angiogenesis and skeletal development. The genes associated with skeletal development were growth and differentiation factors [transforming growth factor beta 1 (TGFB1) and bone morphogenetic protein 4 (BMP4)], extracellular matrix proteins [chondroadherin (CHAD), collagen type I, alpha 1 chain (COL1A1), collagen type I, alpha 2 chain (COL1A2), collagen type Ⅴ, alpha 2 chain (COL5A2), decorin (DCN), osteonectin (SPARC) and osteocalcin (BGLAP)] and so on. Furthermore, it was found that some of the up-regulated genes at the 4th week were associated with the signaling of transforming growth factor beta/bone morphogenetic protein (TGF-β/BMP) shown by KEGG analysis. The upstream genes of wingless-type MMTV integration site family (WNT) signaling, WNT5A and frizzled receptor 9 (FZD9), were up-regulated at the 2nd week, while the important downstream gene catenin beta 1 (CTNNB1) was up-regulated at the 4th week.CONCLUSIONAfter 2 weeks of maxillary sinus floor elevation by the lateral window approach, the transcriptome is characterized by down-regulation of the genes associated with immuno-inflammatory response and bone resorption, and up-regulation of the genes associated with osteogenesis. Neurogenesis and angiogenesis are closely related to bone regeneration. The TGF-β/BMP and WNT signaling pathways play an important role in the bone regeneration process. The effect of WNT signaling is complicated.

Maxillary sinus floor elevation; Guided bone regeneration; Osteogenesis; Transcriptome; TGF-β/BMP signaling pathway

R782.1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.025

1000- 4718(2013)06- 1102- 12

2013- 01- 24

2013- 03- 27

廣東省科技廳基金資助項目(No. 2009B050700025;No. 2010B060900070;No. 2011B010200008)；廣東省自然科學(xué)基金博士科研啟動基金資助項目(No. S201140002559)

△通訊作者 Tel: 020-87332200-8721; E-mail: chensongling1@gmail.com