鄭蘇梨， 謝良地， 李宏亮， 梁敏烈， 許昌聲

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建省高血壓研究所，福建 福州 350005)

·論著·

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對野百合堿誘發(fā)的肺動脈高壓大鼠肺動脈鈣離子通道的影響*

鄭蘇梨， 謝良地△， 李宏亮， 梁敏烈， 許昌聲

(福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建省高血壓研究所，福建 福州 350005)

目的探討脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)移植對野百合堿(monocrotaline,MCT)誘發(fā)的肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)大鼠肺動脈鈣離子通道的影響。方法膠原酶消化法分離培養(yǎng)ADMSCs。雄性SD大鼠24只，分為正常對照組(Ctr組)、PAH組和ADMSCs組，每組8只。右心導(dǎo)管法測定大鼠的平均肺動脈壓(MPAP)；稱重法測右心室肥厚指數(shù)(RVHI)；分別用RT-PCR及Western blotting法測定大鼠肺動脈干電壓門控性鈣離子通道α1c亞基(CaVα1c)肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+ATP酶2a(SERCA-2a)、三磷酸肌醇受體1(IP3R-1)、瞬時受體電位通道1(TRPC1)和TRPC6 mRNA和蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果(1)MCT注射4周后，與Ctr組相比， PAH組大鼠MPAP和RVHI均顯著升高(P<0.05)；ADMSCs移植2周后，與PAH組相比，ADMSCs組MPAP和RVHI均明顯降低(P<0.05)。(2)與Ctr組相比，PAH組大鼠肺動脈CaVα1c、TRPC1和TRPC6 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯增強(qiáng)(P<0.05)，SERCA-2a 和IP3R-1 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)；與PAH組相比，ADMSCs組CaVα1c、TRPC1和TRPC6的表達(dá)均明顯降低(P<0.05)，SERCA-2a 和IP3R-1的表達(dá)均明顯增強(qiáng)(P<0.05)。結(jié)論ADMSCs能有效地降低MCT誘發(fā)的PAH大鼠的肺動脈壓力，減輕右心室肥厚。ADMSCs降低肺動脈壓力可能與鈣離子通道變化有關(guān)。

脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞； 肺動脈高壓； 鈣通道

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種難治性疾病，以肺動脈壓力和肺血管阻力升高為主要特點，可逐漸進(jìn)展為右心室衰竭，甚至死亡。肺血管重構(gòu)，最終導(dǎo)致肺小動脈管腔的阻塞，是肺動脈高壓的主要發(fā)病機(jī)制[1]。肺動脈平滑肌細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度(intracellular free calcium，[Ca2+]i)升高是引起肺血管收縮的重要因素。電壓門控性鈣離子通道α1c亞基(voltage-gated calcium channel α1c subunit, CaVα1c)、肌漿/內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+ATP酶 2a(sarcoplasmic/endoplasmic reticulum cal-cium ATPase 2a,SERCA-2a)、三磷酸肌醇受體 1(inositol 1,4,5-triphosphate receptor 1, IP3R-1)和瞬時受體電位通道[2](transient receptor potential channel,TRPC)是調(diào)節(jié)[Ca2+]i的重要鈣離子通道亞基。我們先前的研究證實[3]，PAH大鼠肺動脈存在CaVα1c、SERCA-2a和IP3R-1的表達(dá)異常。目前用于治療PAH的藥物主要有鈣離子通道阻滯劑、前列腺素類、內(nèi)皮素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑等，但療程長，費用昂貴，而且療效有限。近年來，國內(nèi)外一些研究表明移植干細(xì)胞有助于改善肺血管的內(nèi)皮功能，降低肺動脈壓力并且改善肺小動脈的重構(gòu)[4-6]。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells，ADMSCs)是從脂肪組織中分離出的多潛能干細(xì)胞，具有促進(jìn)血管生成、抑制炎癥等特性[7-8]。而且，ADMSCs來源豐富，易獲取，無倫理學(xué)上的限制，具有良好的應(yīng)用前景。本文主要研究ADMSCs移植對野百合堿(monocrotaline,MCT)誘導(dǎo)的PAH大鼠肺動脈鈣離子通道的影響，探討ADMSCs治療PAH的可能性及其機(jī)制。

材 料 和 方 法

1脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)

無菌條件下取雄性SD大鼠(100～150 g，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司)雙側(cè)腹股溝皮下脂肪，參照文獻(xiàn)[9-10]報道的方法分離培養(yǎng)ADMSCs。取生長良好的第3代ADMSCs，融合達(dá)50%時，加入感染復(fù)數(shù)為100的Ad5-EGFP重組腺病毒感染ADMSCs。

2動物分組及肺動脈高壓模型建立

雄性SD大鼠24只(200～230 g，上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司)，隨機(jī)分為3組，每組8只：正常對照組(Ctr組)、MCT誘導(dǎo)組(PAH組)和MCT誘導(dǎo)+ADMSCs治療組(ADMSCs組)。PAH組和ADMSCs組均按文獻(xiàn)報道[11-12]的方法配制MCT(Sigma)，予腹腔一次性注射40 mg/kg，正常對照組給予等體積生理鹽水腹腔注射。

3脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞移植

MCT注射后2周，胰酶消化綠色熒光標(biāo)記的ADMSCs，調(diào)整細(xì)胞懸液密度為1×109cells/L，ADMSCs組經(jīng)頸外靜脈移植ADMSCs細(xì)胞1 mL，鏈霉素1×105U肌肉注射預(yù)防感染。Ctr組及PAH組給予等體積生理鹽水。實驗結(jié)束后，取ADMSCs組肺組織行冰凍切片，觀察綠色熒光標(biāo)記細(xì)胞在肺組織中的定植。

4血流動力學(xué)檢測

按孫波等[13]的報道，在本實驗室建立測定大鼠平均肺動脈壓(mean pulmonary arterial pressure, MPAP)的方法，MCT注射4周后測量各組MPAP。

5肺組織HE染色切片制作

血流動力學(xué)檢測后，打開胸腔取出整個心肺，肺動脈干保存在液氮罐內(nèi)，右肺中葉組織塊以10%甲醛溶液固定1 d。常規(guī)石蠟包埋，沿右肺門水平橫切，片厚5 μm。切片進(jìn)行HE染色，制成病理切片。光鏡下觀察肺小動脈病變。

6右心室肥厚指數(shù)(rightventricularhypertrophyindex,RVHI)的測定

取出整個心臟，沿房室溝剪去心房及大血管根部，用剪刀沿后室壁間溝將右心室切下，濾紙吸水后稱右心室游離壁(right ventricular,RV)及左心室+室間隔(left ventricular and ventricular septum,LV+S)的重量，并計算RVHI：RVHI=RV/(LV+S)。

7RT-PCR檢測

從液氮中取出肺動脈干，采用Invitrogen公司Trizol試劑盒提取總RNA，752-C紫外分光光度計測定其純度及含量。按照Promega公司試劑盒說明書進(jìn)行cDNA第1鏈的合成，采用Primer 3.0軟件設(shè)計PCR引物(表1)，進(jìn)行擴(kuò)增(MyGene 32 Thermal Block PCR儀)。以大鼠GAPDH mRNA為內(nèi)參照，進(jìn)行半定量分析，比值表示其相對含量。

表1 RT-PCR引物序列

8Westernblotting檢測

提取總蛋白后，Bradford法測定各樣品蛋白質(zhì)濃度，經(jīng)SDS-PAGE分離，1 mA/cm2轉(zhuǎn)膜,5%脫脂奶粉中室溫下封閉1 h，抗CaVα1c抗體(1∶200，Alomone Labs)和抗SERCA-2a抗體(1∶1 000，Abcam)、抗IP3R-1抗體(1∶1 000，Millipore)、抗TRPC1抗體(1∶200，Alomone Labs)和抗TRPC6抗體(1∶200，Alomone Labs)4 ℃孵育過夜。加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的Ⅱ抗(1∶2 000，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，37 ℃孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光法(ECL)顯影。以β-actin作為內(nèi)參照，進(jìn)行半定量分析，比值表示其相對含量。

9統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。采用SPSS 11.5統(tǒng)計軟件分析。組間均數(shù)比較采用One-way ANOVA檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1ADMSCs治療對MCT誘發(fā)的PAH大鼠血流動力學(xué)的影響

與Ctr組相比，PAH組的MPAP及RVHI均明顯升高(P<0.01)；與PAH組相比，ADMSCs組MPAP及RVHI均顯著降低(P<0.01)，見表2。

表2ADMSCs治療對大鼠血流動力學(xué)的影響

Table 2. Effects of ADMSCs transplantation on mean pulmonary arterial pressure (MPAP) and right ventricular hypertrophy index (RVHI) of rats (Mean±SD.n=8)

GroupMPAP(mmHg)RVHICtr15.03±0.8725.67±1.26PAH32.22±0.71**53.44±2.13**ADMSCs21.87±0.78△△38.97±1.59△△

**P<0.01vsCtr group;△△P<0.01vsPAH group.

2肺小動脈顯微結(jié)構(gòu)觀察

Ctr組大鼠肺小動脈管壁厚薄一致，管腔內(nèi)膜結(jié)構(gòu)完整，血管周圍僅有少量結(jié)締組織，見圖1A；PAH組大鼠肺小動脈管壁增厚、管腔縮小，管腔內(nèi)膜結(jié)構(gòu)不完整或斷裂，血管周圍有大量結(jié)締組織增生，管壁有大量細(xì)胞浸潤，見圖1B；ADMSCs組大鼠肺小動脈管壁厚度輕度增加，較均勻，管腔縮小不明顯，見圖1C。

3ADMSCs在大鼠肺組織定植

冰凍切片熒光觀察， ADMSCs組大鼠的肺組織血管中可見綠色熒光細(xì)胞分布，Ctr組大鼠的肺組織未見綠色熒光信號，見圖2。

Figure 1. Effects of ADMSCs on histological changes of small pulmonary arteries (HE staining,×100). A: Ctr group;B: PAH group;C: ADMSCs group.

圖1大鼠肺小動脈組織學(xué)改變

Figure 2. GFP-labeled ADMSCs were observed in pulmonary tissues (×200).A,B:Ctr group;C,D:ADMSCs group.A,C:phase-contrast images;B,D:fluorescence images.The white arrow indicates GFP-labeled ADMSCs.

圖2GFP標(biāo)記的ADMSCs定植于肺組織的熒光顯微鏡觀察

4ADMSCs治療對MCT誘發(fā)的PAH大鼠肺動脈鈣離子通道m(xù)RNA及蛋白的影響

4.1ADMSCs對PAH大鼠肺動脈CaVα1c表達(dá)的影響 與Ctr組相比，PAH組肺動脈CaVα1c mRNA及蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)。ADMSCs組的CaVα1c表達(dá)水平較PAH組明顯降低(P<0.05)，見圖3。

4.2ADMSCs對PAH大鼠肺動脈SERCA-2a表達(dá)的影響 與Ctr組相比，PAH組肺動脈SERCA-2a mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與PAH組相比，ADMSCs組的SERCA-2a表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，見圖4。

4.3ADMSCs對PAH大鼠肺動脈IP3R-1表達(dá)的影響 與Ctr組相比，PAH組肺動脈IP3R-1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與PAH組相比，ADMSCs組的IP3R-1表達(dá)水平明顯增高(P<0.05)，見圖5。

4.4ADMSCs對PAH大鼠肺動脈TRPC1表達(dá)的影響 與Ctr組相比，PAH組肺動脈TRPC1 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)。與PAH組相比，ADMSCs組的IP3R-1表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見圖6。

4.5ADMSCs對PAH大鼠肺動脈TRPC6表達(dá)的影響 與Ctr組相比，肺動脈高壓組肺動脈TRPC6 mRNA及蛋白表達(dá)明顯增高(P<0.05)。與PAH組相比，ADMSCs組的TRPC6表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)，見圖7。

討 論

本研究采用MCT成功誘導(dǎo)了PAH模型，PAH組MPAP和RVHI均明顯高于Ctr組，HE染色可見肺小動脈管壁增厚、管腔縮小，管腔內(nèi)膜結(jié)構(gòu)破壞，血管周圍結(jié)締組織增生。本研究發(fā)現(xiàn)，移植綠色熒光蛋白標(biāo)記的ADMSCs后，大鼠肺組織血管中可檢測到熒光，說明ADMSCs定植在大鼠的肺組織內(nèi)。陳明等[14]利用腺病毒感染標(biāo)記ADMSCs，經(jīng)靜脈移植后可歸巢于宿主特定組織并分化為內(nèi)皮細(xì)胞，并認(rèn)為ADMSCs對血管內(nèi)皮有修復(fù)功能。本研究移植ADMSCs后，發(fā)現(xiàn)MPAP和RVHI較PAH組明顯降低，肺小動脈管壁結(jié)構(gòu)改善，內(nèi)膜完整，管腔面積擴(kuò)大，說明ADMSCs可能通過定植并分化為內(nèi)皮細(xì)胞，修復(fù)血管內(nèi)皮屏障而起到延緩肺動脈高壓進(jìn)展的作用。何志旭等[15]經(jīng)靜脈移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，其可定植于肺間質(zhì)，通過形成新生血管建立側(cè)枝循環(huán)，有效減輕MCT誘導(dǎo)的肺動脈高壓和肺組織病變程度。Liu等[16]研究也發(fā)現(xiàn)，移植自體脂肪間充質(zhì)細(xì)胞可降低PAH大鼠平均肺動脈壓，改善肺小血管重構(gòu)，同時肝細(xì)胞生長因子及一氧化氮合酶表達(dá)增加，進(jìn)而促進(jìn)肺血管再生。近年來對脂肪干細(xì)胞分泌蛋白質(zhì)組的研究也發(fā)現(xiàn)[17-19]，脂肪干細(xì)胞可分泌血管內(nèi)皮生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子、肝細(xì)胞生長因子等多種可溶性因子，在血管生成、組織修復(fù)過程中發(fā)揮了重要作用。

Figure 3. Effects of ADMSCs transplantation on CaVα1c mRNA (A) and protein (B) levels in pulmonary hypertensive rats. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsCtr group；△P<0.05vsPAH group.

圖3ADMSCs對PAH大鼠肺動脈CaVα1cmRNA及蛋白表達(dá)水平的影響

Figure 4. Effects of ADMSCs transplantation on SERCA-2a mRNA (A) and protein (B) levels in pulmonary hypertensive rats. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCtr group；△P<0.05vsPAH group.

圖4ADMSCs對PAH大鼠肺動脈SERCA-2amRNA及蛋白表達(dá)水平的影響

Figure 5. Effects of ADMSCs transplantation on IP3R-1 mRNA (A) and protein (B) levels in pulmonary hypertensive rats. Mean±SD.n=5.**P<0.01vsCtr group；△△P<0.01vsPAH group.

圖5ADMSCs對PAH大鼠肺動脈IP3R-1mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響

Figure 6. Effects of ADMSCs transplantation on TRPC1 mRNA (A) and protein (B) levels in pulmonary hypertensive rats. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCtr group；△P<0.05vsPAH group.

圖6ADMSCs對PAH大鼠肺動脈TRPC1mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響

Figure 7. Effects of ADMSCs transplantation on TRPC6 mRNA (A) and protein (B) levels in pulmonary hypertensive rats. Mean±SD.n=5.*P<0.05vsCtr group；△P<0.05vsPAH group.

圖7ADMSCs對PAH大鼠肺動脈TRPC6mRNA及蛋白表達(dá)水平的影響

目前研究認(rèn)為PAH引起MPAP增高與肺血管痙攣收縮及重構(gòu)密切相關(guān)[20]，也有研究認(rèn)為血管壁增厚、血管重構(gòu)與平滑肌細(xì)胞鈣離子通道表達(dá)異常有關(guān)[21]。Roberto等[22]研究發(fā)現(xiàn)，增殖型平滑肌細(xì)胞中IP3R、TRPC1、TRPC6等鈣離子通道蛋白表達(dá)明顯升高；Liu等[23]研究還發(fā)現(xiàn)，PAH大鼠肺動脈TRPC1和TRPC6表達(dá)明顯升高；Dinesh等[24]研究發(fā)現(xiàn)CaVα1c表達(dá)上調(diào)與RVHI增加及管壁增厚有關(guān)；Katharina等[25]認(rèn)為SERCA表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞過度增殖。本研究發(fā)現(xiàn)，與Ctr組相比，PAH組CaVα1c、TRPC1和TRPC6表達(dá)明顯增高，SERCA-2a和IP3R-1表達(dá)明顯降低。IP3R可引起肌漿網(wǎng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子釋放，并通過“鈣誘導(dǎo)鈣釋放”途徑使得鈣離子持續(xù)釋放，亦誘導(dǎo)其它鈣離子通道的開放，另外細(xì)胞膜上CaVα1c、TRPC1和TRPC6等鈣離子通道表達(dá)的增加，可引起細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流增加，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高。而肌漿網(wǎng)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的SERCA-2a表達(dá)減少，導(dǎo)致鈣離子泵回減少，使得細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度進(jìn)一步升高。本實驗中，隨著肺動脈高壓的進(jìn)展，細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度處于持續(xù)高濃度狀態(tài)，反而抑制了IP3R的表達(dá)，Haeri等[26]也認(rèn)為，IP3R與鈣離子濃度間存在非線性關(guān)系，高濃度的鈣離子對IP3R有抑制作用。同時，我們還發(fā)現(xiàn)，與PAH組相比，ADMSCs組CaVα1c、TRPC1和TRPC6表達(dá)明顯降低(P<0.05)，SERCA-2a 和IP3R-1表達(dá)較PAH組明顯增強(qiáng)(P<0.05)，提示ADMSCs可調(diào)節(jié)鈣離子通道的表達(dá)。遺憾的是，本實驗沒有動態(tài)觀察肺動脈高壓進(jìn)展過程中鈣離子通道的變化及細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的變化。

總之，本研究證實肺動脈高壓時存在鈣離子通道表達(dá)異常，可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度升高促進(jìn)肺血管收縮。我們推測ADMSCs通過調(diào)節(jié)鈣離子通道表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度而延緩肺動脈高壓的進(jìn)展。但本研究中ADMSCs對鈣離子通道的影響是由于其組織修復(fù)作用還是繼發(fā)于肺動脈壓力下降后的作用仍未明確，有待進(jìn)一步深入研究。

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Effectsofadiposetissue-derivedmesenchymalstemcellsoncalciumchannelsofpulmonaryarteryinratswithpulmonaryarterialhypertensioninducedbymonocrotaline

ZHENG Su-li, XIE Liang-di, LI Hong-liang, LIANG Min-lie, XU Chang-sheng

(FujianHypertensionInstitute,TheFirstAffiliatedHospitalofFujianMedicalUniversity,Fuzhou350005,China.E-mail:ldxie@hotmail.com)

AIM: To investigate the effects of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells (ADMSCs) on calcium channels of pulmonary artery in monocrotaline (MCT)-induced pulmonary hypertensive rats.METHODSADMSCs were isolated from adipose tissue by collagenase digestion. Twenty-four Sprague-Dawley rats were randomly divided into 3 groups: normal control (Ctr) group, pulmonary arterial hypertension (PAH) group and ADMSCs transplantation group. Mean pulmonary arterial pressure (MPAP) was measured by catheterization, and right ventricular hypertrophy index (RVHI) was calculated. The expression of voltage-gated calcium channel α1c subunit (CaVα1c), sarcoplasmic/endoplasmic reticulum calcium ATPase 2a (SERCA-2a), inositol 1,4,5-triphosphate receptor 1(IP3R-1), transient receptor potential channel 1 (TRPC1) and TRPC6 at mRNA and protein levels in the pulmonary trunks was determined by RT-PCR and Western blotting, respectively.RESULTSMPAP and RVHI were higher in PAH group than those in Ctr group, while those in ADMSCs group were significantly decreased as compared with PAH group. The expression of CaVα1c, TRPC1 and TRPC6 at mRNA and protein levels was obviously increased in PAH group as compared with Ctr group, while that in ADMSCs group was significantly decreased as compared with PAH group. Compared with Ctr group, the expression of SERCA-2a and IP3R-1 at mRNA and protein levels was obviously decreased in PAH group, while that in ADMSCs group was significantly increased as compared with PAH group.CONCLUSIONMPAP and RVHI are attenuated by ADMSCs in MCT-induced pulmonary hypertensive rats. The reduction of pulmonary arterial pressure by ADMSCs transplantation in MCT-induced pulmonary hypertensive rats may be related to the changes of calcium channels.

Adipose tissue-derived mesenchymal stem cells; Pulmonary arterial hypertension; Calcium channels

R363

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2013.06.001

1000- 4718(2013)06- 0961- 08

2012- 12- 07

2013- 04- 15

國家自然科學(xué)基金資助項目(No. 81270111/H0109)

△通訊作者 Tel： 0591-87982618； E-mail： ldxie@hotmail.com