吳 杰

(中國礦業(yè)大學)

0 引言

Src是膜結(jié)合非受體酪氨酸蛋白激酶家族成員之一，在神經(jīng)元的增殖、分化和存活中起著重要的生理作用［1-2］.Src在中樞神經(jīng)系統(tǒng)均有表達，并且發(fā)現(xiàn)在大腦海馬區(qū)高度表達［2，3］.大腦海馬區(qū)是主要負責學習和記憶的腦區(qū)，海馬神經(jīng)元的損傷可導致腦缺血、老年癡呆等神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生［4-5］.研究表明，Src參與谷氨酸興奮毒等神經(jīng)病理過程，在海馬神經(jīng)元的損傷中發(fā)揮重要作用［6-8］.該研究擬構(gòu)建Src的真核表達載體，為進一步研究Src的結(jié)構(gòu)與功能以及其在神經(jīng)退行性疾病的分子機制奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒及細胞

大腸桿菌JM101、HEK293T細胞均為本實驗室保存，真核表達載體pcDNA3.1(+)購自Invitrogen公司.

1.2 試劑

RNAgents Total RNA Isolation System、Acess RT-PCR System、Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System、T4 DNA ligase、瓊脂糖、NBT/BCIP顯色系統(tǒng)購自Promega公司;限制性內(nèi)切酶BamH I和EcoR I購自New England Biolabs公司;PuriLink Hipure Plasmid Midiprep Kit、1 Kb DNA ladder購自Invitrogene公司;鼠源抗Src抗體購自Upstate公司;兔源抗Actin抗體購自Cell Signaling公司;AP標記的鼠/兔二抗均購自Sigma公司.

1.3 引物設(shè)計及合成

根據(jù)Genebank中的大鼠Src基因編碼序列(GI:4574718)，設(shè)計上下游引物，在上游引物的5’端引入BamH I酶切位點，下游引物的5’端引入EcoR I酶切位點(下劃線)，引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成.

上游引物:5’-CGGGATCCCGATGGGCAGCAACAAGAGC-3’

下游引物:5’-CGGAATTCCGCTATAGGTTCTCCCCGGGC-3’

1.4 目的基因的擴增

以SD雄性大鼠海馬為材料，RNA提取試劑盒提取大鼠海馬總RNA.以RNA為模板，用設(shè)計合成的Src的上下游引物經(jīng)RT-PCR擴增出長約1600 bp的Src的全長DNA片段.

1.5 Src-pcDNA3.1真核表達載體的構(gòu)建

將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠回收，然后將PCR產(chǎn)物和pcDNA3.1載體分別用限制性內(nèi)切酶BamH I/EcoR I進行雙酶切.瓊脂糖凝膠回收酶切產(chǎn)物，將酶切產(chǎn)物(Src的 PCR產(chǎn)物與pcDNA3.1)進行連接，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞JM101，提取的質(zhì)粒經(jīng)BamH I/EcoR I雙酶切鑒定，陽性重組子進行序列測定.測序正確的重組子經(jīng)PuriLink Hipure Plasmid Midiprep Kit試劑盒進行大量制備，留待轉(zhuǎn)染HEK293T細胞進行蛋白表達的鑒定.

1.6 HEK293T細胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染

HEK293T細胞于10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱孵育.將重組質(zhì)粒和PEI分別稀釋于DMEM培養(yǎng)基，混勻，然后將稀釋液混合充分，室溫放置15 min，在此期間將細胞培養(yǎng)基換為無血清DMEM培養(yǎng)基，15 min后將質(zhì)粒與PEI的混合物加到HEK293T細胞培養(yǎng)基中，2-3 h后更換含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基.24 h后，收集細胞樣品.

1.7 蛋白含量測定

收集的細胞樣品經(jīng)超聲破碎后，按改良Lowry法，以牛血清白蛋白為標準蛋白.

1.8 免疫印跡

于含相同蛋白量的樣品中加入4×laemmli蛋白上樣緩沖液(62.5 mM Tris– HCl(pH 6.8)，2% SDS，1% β -mercaptoethanol，5%glycerol，0.003%bromophenol blue)，置沸水浴中5 min變性處理.取等量蛋白樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后，電轉(zhuǎn)移至NC膜上.將NC膜于封閉液中室溫孵育3 h后，加入一抗工作液，室溫孵育30 min后于4℃孵育過夜，次日用washing buffer(10 mM Tris-HCl，pH 7.5，100 mM NaCl，0.1%Tween-20)洗膜(3 min×5次)后，加入AP標記的二抗工作液，室溫孵育2 h，washing buffer洗膜(3 min×5次).使用NBT/BCIP試劑盒顯色，流水洗滌終止反應，掃描膜上顯色條帶.

2 結(jié)果

2.1 大鼠海馬Src cDNA的擴增

利用總RNA抽提試劑盒提取大鼠海馬總RNA，后進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定.由圖1所示，可檢測到明顯的28 S和18 S的RNA條帶，另外有少量的5 S條帶.結(jié)果表明，大鼠海馬總RNA成功提取.

圖1 大鼠海馬總RNA電泳圖

利用特異性引物，以提取的總RNA為模板，采用RT-PCR技術(shù)擴增Src長1611 bp的DNA片段，后將RT-PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定.如圖2所示，可檢測到一條約1600 bp的DNA條帶，與預期目的基因分子量大小相符.結(jié)果提示，Src的cDNA片段成功擴增.

圖2 Src的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

2.2 真核表達載體Src-pcDNA3.1的構(gòu)建

將擴增的Src的DNA片段和真核表達載體pcDNA3.1分別進行BamH I和EcoR I雙酶切，后將目的片段亞克隆入pcDNA3.1，篩選陽性重組子.經(jīng)雙酶切鑒定，瓊脂糖電泳顯示一條長約5400 bp的pcDNA3.1載體片段和約1600 bp的目的基因片段(圖3).測序結(jié)果表明，Src核酸序列與Genbank中序列完全一致.結(jié)果表明，SrcpcDNA3.1真核表達載體成功構(gòu)建.

2.3 真核表達載體Src-pcDNA3.1在HEK293T細胞中的表達

圖3 Src-pcDNA3.1雙酶切產(chǎn)物電泳圖

將 Src-pcDNA3.1、pcDNA3.1轉(zhuǎn)染入HEK293T細胞，收集細胞樣品，經(jīng)SDS-PAGE分離后，以抗Src的抗體進行免疫印跡分析.結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Src-pcDNA3.1組檢測到明顯的Src條帶，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1組和未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒組只檢測到微弱的內(nèi)源性Src條帶(圖4).結(jié)果表明，Src的重組體在HEK293T細胞得到了高效表達.

圖4 免疫印跡分析Src-pcDNA3.1在HEK293T細胞中的蛋白表達

3 討論

大腦海馬區(qū)是負責認知功能的重要腦區(qū)，海馬神經(jīng)元的損傷可導致神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生［4-5］.因此，神經(jīng)元損傷分子機制的闡明有望為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治提供理論依據(jù)和潛在的藥物作用靶點.

Src在海馬中高度表達，是神經(jīng)元突觸后膜的一個重要酪氨酸蛋白激酶［3，9］.研究表明，Src可使離子型谷氨酸受體NMDA受體GluN2A亞基磷酸化，從而促進 NMDA受體的活化［10-12］.過度活化的NMDA受體促發(fā)一系列鈣依賴性反應，最終導致神經(jīng)元的死亡和損傷［13］.該研究成功構(gòu)建了Src的真核表達載體，并且檢測到其在HEK293T細胞中可高效表達.可以在細胞和分子水平更好的闡明Src在神經(jīng)元損傷中的分子機制，從中篩選干預神經(jīng)元損傷的靶點，為神經(jīng)退行性疾病的防治提供有效的藥物作用靶點，有著非常重要的醫(yī)學價值和實踐意義.

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