沈驊睿 扶世杰 汪國友 李光勝 徐祖健 陳貴全

中藥仙茅不同有效成分對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)作用的比較

沈驊睿 扶世杰 汪國友 李光勝 徐祖健 陳貴全

目的 比較中藥仙茅中不同有效成份對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞誘導(dǎo)作用的差異。方法 分別采用RT-PCR檢測和倒置顯微鏡下觀察的方法, 對使用中藥仙茅多糖和仙茅黃酮誘導(dǎo)刺激后的骨髓間質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行檢測, 觀察仙茅不同有效成分對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞刺激后的變化。結(jié)果 仙茅多糖和仙茅黃酮成分均能誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)分化。結(jié)論 仙茅黃酮較仙茅多糖對骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的作用更強(qiáng)。

仙茅多糖；仙茅黃酮；骨髓間質(zhì)干細(xì)胞；神經(jīng)元細(xì)胞；神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞

最近研究表明, 骨髓間質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)具有在一定條件下分化為神經(jīng)細(xì)胞、成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和肌母細(xì)胞的強(qiáng)大潛能。因此如何誘導(dǎo)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞的分化并成功應(yīng)用于臨床成為研究熱點(diǎn)。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為“腎主骨生髓”,基于幾千年中醫(yī)臨床實(shí)踐, 常以“溫腎壯陽, 填精益髓”為治療原則, 治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病。前期研究結(jié)果證明, 仙茅作為傳統(tǒng)溫腎壯陽之要藥, 其水提物具有明確促進(jìn)骨髓間質(zhì)干細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的作用, 但其作用核心有效成分或單體成分是什么尚屬空白。本研究選擇仙茅中多糖類和黃酮類兩大主體成分, 分別對成年大鼠骨髓間質(zhì)干細(xì)胞體外轉(zhuǎn)化為神經(jīng)細(xì)胞進(jìn)行研究, 并比較兩類成分作用的差異性, 為進(jìn)一步的有效單體成分研究及后期臨床應(yīng)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)?，F(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑 選用2月齡SD大鼠, 體重180～200 g, 雌雄各3只(由成都中醫(yī)藥大學(xué)試驗(yàn)動物中心提供)；仙茅多糖、仙茅黃酮提取物(由成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院提供,CO60照射消毒)；胎牛血清(中美蘭州民海生物公司)；胰酶(美國Amresco公司 )；改良伊格爾髙糖培養(yǎng)基(DMEM)(美國Gibco公司)；二甲基亞砜(DMSO)(美國Gibco公司純度99.5%)；青霉素(成都制藥一廠, 批號20040526)；鏈霉素(成都制藥一廠, 批號20040326)；D-Hanks平衡鹽溶液(美國Hyclone公司)；TriZol 試劑(美國Invitrogen公司)；PCR引物[NSE 、GFAP, 寶生物工程(大連)有限公司, 引物序列及產(chǎn)物大小見表1]；25 cm2塑料培養(yǎng)瓶、6孔板(美國Orange公司)。

表1 引物序列及產(chǎn)物大小

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大鼠MSCs的分離與培養(yǎng) 無菌條件下取出大鼠股骨, 剪去股骨兩端, 用含10%DMEM培養(yǎng)液沖洗骨髓腔,反復(fù)離心洗滌后, 收集骨髓細(xì)胞懸浮液, 接種在培養(yǎng)瓶中,37℃、5%CO2培養(yǎng)。24小時(shí)和48小時(shí)后, 完全換液, 去掉未貼壁的細(xì)胞, 以后每隔3天半量換液。10～14天細(xì)胞接近融和, 0.125%胰酶消化傳代。

1.2.2 定向誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)元分化 細(xì)胞RT-PCR樣本的制作：將第3代的骨髓細(xì)胞經(jīng)記數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度為1×105/ml,接種于6孔培養(yǎng)板中, 每孔加細(xì)胞懸液3 ml。在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h, 隨機(jī)分組為仙茅多糖組、仙茅黃酮組、陽性對照藥物組——二甲基亞砜(DMSO)和空白組, 各2孔, 先移去1.5 ml培養(yǎng)液, 仙茅多糖組、仙茅黃酮組、陽性對照藥物組分別加入由10%DMEM配置的1%仙茅多糖提取液、0.1%仙茅黃酮提取液、4%DMSO各1.5 ml, 空白組加入10%DMEM1.5 ml。持續(xù)刺激72小時(shí)后。0.125%胰酶消化下細(xì)胞送檢。

1.2.3 誘導(dǎo)細(xì)胞鑒定

1.2.3.1 RT-PCR檢測 以神經(jīng)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白—神經(jīng)元烯醇酶((NSE)和星形膠質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志性蛋白—膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)檢測其mRNA的表達(dá)。

1.2.3.2 倒置顯微鏡下觀察 分別于加藥前和加藥后, 在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的改變。

2 結(jié)果

2.1 RT-PCR檢測對mRNA半定量測定結(jié)果 經(jīng)測定, 4樣本中均有NSE和GFAP表達(dá)。仙茅多糖組樣本、仙茅黃酮組樣本中NSE的mRNA表達(dá)明顯高于空白樣本, 仙茅黃酮組樣本NSE表達(dá)接近DMSO樣本, 但仙茅多糖組樣本明顯低于DMSO樣本。仙茅多糖組樣本中GFAP的mRNA表達(dá)量明顯高于其余3組樣本, 而仙茅黃酮組樣本中GFAP的mRNA表達(dá)量明顯低于其余3組樣本(結(jié)果見表2、3)。

表2 NSE中mRNA表達(dá)效果比較

表3 GFAP中mRNA表達(dá)效果比較

2.2 倒置顯微鏡小觀察結(jié)果 仙茅多糖組樣本、仙茅黃酮組樣本和DMSO樣本在誘導(dǎo)48小時(shí)后, 卵圓形細(xì)胞明顯減少,72小時(shí)后可見大量神經(jīng)元樣細(xì)胞出現(xiàn), 其觸突明顯長出。胞體較大, 細(xì)胞核大而較為透明, 有較為明顯的細(xì)胞核, 核/質(zhì)較大, 有長的觸突生長。而空白對照樣本物變化較小。

3 討論

通過此次試驗(yàn), 我們可以得到三個(gè)結(jié)論。

3.1 雖然前期研究結(jié)果證明仙茅水提物對誘導(dǎo)MSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化有明確的作用, 在分子生物學(xué)水平證明了中醫(yī)“腎主骨, 生髓” 理論的正確性, 但水提物中成分復(fù)雜, 不能明確其有效作用成分。本次研究進(jìn)一步證明仙茅多糖、仙茅黃酮對MSCs的誘導(dǎo)作用存在差異, 其作用機(jī)理尚不清楚,可能與其化學(xué)結(jié)構(gòu)中抗氧化基團(tuán)或極性基團(tuán)有關(guān)。3.2 在本試驗(yàn)的空白組中, 同樣檢測到有NSE和GFAP的mRNA表達(dá), 這表明MSCs在體外未給藥物刺激的環(huán)境下有分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的可能性, 且產(chǎn)生了不同于體內(nèi)的分化方式, 分化出神經(jīng)元細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞。尤其仙茅多糖組樣本、仙茅黃酮組樣本的RT-PCR檢測結(jié)果明顯不同于空白對照組, 表明中藥仙茅不同成分促進(jìn)了對應(yīng)的分化作用。

3.3 前期研究表明仙茅水提物在促進(jìn)MSCs向神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)化的時(shí)候也增加了神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。仙茅黃酮仙對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)作用更強(qiáng), 其膠質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化較少。而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中少突膠質(zhì)細(xì)胞可以抑制軸突再生, 對臨床有積極指導(dǎo)意義。

通過此次試驗(yàn), 我們得到一種體外獲得神經(jīng)細(xì)胞的培養(yǎng)方法, 并可為以后治療神經(jīng)損傷進(jìn)行細(xì)胞移植和新藥開發(fā)提供新的研究思路, 并為以后細(xì)胞移植的人體試驗(yàn)打下了很好的基礎(chǔ)。

［1］ 李鋼, 柯以銓, 姜曉丹, 等．食蟹猴骨髓基質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的試驗(yàn)研究．解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2002, 27(11):956-959.

［2］ 邵明, 張軍, 張信英, 等.骨髓基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)后與神經(jīng)細(xì)胞的比較研究.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志, 2003, 20(1): 8-10.

［3］ 薛慶善, 肖與平, 林娟．體外培養(yǎng)的原理與技術(shù)．科學(xué)出版社,2001:467-469.

Comparison of different effective ingredients of Rhizoma curculiginis in bone marrow mesenchymal stem cells indued.

SHEN Ye-rui, FU Shi-jie, WANG Guo-you, et al.
Traditional Chinese Medicine Hospital Affiliated to Luzhou medical couege.sichuan 646000, China

Objective Comparison of Chinese medicine Rhizoma curculiginis effective ingredients in different difference of bone marrow mesenchymal stem cells induced by using the method of observation; Method RT-PCR detection and inverted microscope respectively, to detect the polysaccharides and flavonoids from Curculigo orchioides stimulated using traditional Chinese medicine Rhizoma curculiginis after bone marrow mesenchymal stem cells, different observation of Curculigo orchioides the effective components of bone marrow mesenchymal stem cells after stimulation.Results Curculigo polysaccharide and Rhizoma curculiginis flavonoids could induce bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into neurons.Conclusion Curculigo flavonoids is stronger Curculigo polysaccharide on bone marrow mesenchymal stem cells differentiation into neuron cell orientation.

Curculigo polysaccharide; Curculigo flavonoids; Bone marrow mesenchymal stem cells;Neurons; Glial cells

646000 瀘州醫(yī)學(xué)院附屬中醫(yī)醫(yī)院骨科(沈驊睿扶世杰 汪國友 徐祖健 陳貴全)；廣安市人民醫(yī)院骨科(李光勝)

李婷 E-mail：xuebao_shr114@163.com