黃 蕊 趙君朋 文玉軍 徐群淵

(首都醫(yī)科大學(xué)北京神經(jīng)科學(xué)研究所 北京神經(jīng)再生修復(fù)研究重點實驗室 教育部神經(jīng)變性病重點實驗室，北京100069)

GAP-43(growth associated protein-43)是一種特異性存在于神經(jīng)系統(tǒng)的生長相關(guān)蛋白，在神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)再生過程中表達(dá)。20世紀(jì)80年代，人們發(fā)現(xiàn)在低等兩棲類動物蠑螈視神經(jīng)再生時有一種小分子的酸性蛋白隨神經(jīng)再生同步表達(dá)上調(diào)［1-2］。后來了解到，這種蛋白在處于發(fā)育中的神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)廣泛分布，表達(dá)沿神經(jīng)元軸突并在生長錐尤顯豐富;除某些具有較強可塑性的腦區(qū)(如海馬)外，大部分腦區(qū)在成年后表達(dá)水平較低。但神經(jīng)一經(jīng)受損則又可誘其表達(dá)上調(diào)，功能聯(lián)系重建后隨即下降，故被稱為生長相關(guān)蛋白［1-3］，盡管在早期它曾被命名為 B-50、F1、Neuromodulin等。

眾所周知，中樞神經(jīng)再生一直是困擾臨床醫(yī)學(xué)的難題［4-5］。已有研究［5-7］表明，除了在發(fā)育期有表達(dá)外，GAP-43在成年哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后可出現(xiàn)重新表達(dá)，即出現(xiàn)于損傷軸突近側(cè)端再生性出芽的時候。因此，GAP-43一直被認(rèn)為是軸突生長的內(nèi)在決定因子，也是衡量神經(jīng)再生能力的重要標(biāo)志［1］。然而，對于GAP-43在神經(jīng)損傷后修復(fù)作用中的機制以及神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中行使什么功能的問題，人們至今似乎還并不清楚。

選擇GAP-43基因敲除小鼠來研究GAP-43的生理和病理功能，理論上是一種比較理想的實驗?zāi)Ｐ汀５且郧按罅康难芯浚?］證實，GAP-43基因敲除小鼠發(fā)育正常，基本生理和認(rèn)知功能未受到明顯影響。并且，經(jīng)過GAP-43基因敲除的小鼠也就無法觀察其在神經(jīng)系統(tǒng)損傷后重新表達(dá)的程度，也就無法研究其參與軸突再生修復(fù)過程的機制。因此，建立GAP-43高表達(dá)的小鼠動物模型，應(yīng)該可以從另一角度來觀察GAP-43對神經(jīng)系統(tǒng)損傷修復(fù)的作用，意義不言而喻。

為此，我們擬通過包裝GAP-43高表達(dá)的質(zhì)粒，注射到小鼠的受精卵中，培育、建立GAP-43高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠，希望能夠以此為模型，進(jìn)一步深入研究GAP-43在神經(jīng)發(fā)育和再生修復(fù)中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物

實驗動物4周齡SPF級C57BL/6J小鼠，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心提供，實驗動物許可證號:SCXK(京)2009－0007。所有實驗用小鼠均在 SPF級動物房飼養(yǎng)和繁殖。溫度控制在22℃，濕度70%，自動光控(12 h明/12 h暗)，自由采食和飲水。

1.1.2 主要試劑

GAP-43蛋白全長cDNA真核細(xì)胞表達(dá)載體pCEP4-PDGF質(zhì)粒由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動物所惠贈。GAP-43蛋白全長cDNA由上海吉凱公司提供。宿主菌E.coli DH5α為本實驗室保存。核酸內(nèi)切酶KpnI/XhoI購自TaKaRa公司，Wizard?Plus Midipreps DNA Purification System大提質(zhì)粒試劑盒購自Promega公司，Omega Bio小提質(zhì)粒試劑盒及PCR mix購自Invitrogen公司;PCR引物由Invitrogen公司合成。十二烷基硫酸鈉(SDS)、聚氧乙烯單月桂酸酯、丙烯酰胺、N，N'－亞甲雙丙烯酰胺以及兔抗小鼠actin抗體、兔抗小鼠GAP-43抗體均購自Sigma 公司;過硫酸氨 (APS)N，N，N'，N'－四甲基乙二胺(TEMED)為Gibco公司產(chǎn)品，HRP標(biāo)記山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG為北京中山生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，BCA蛋白定量試劑盒購自Pierce公司，Kodak BioMax MR X-光片來自Kodak公司，封閉用正常山羊血清購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司，Alexa flour 488/594標(biāo)記的山羊抗小鼠/抗兔 IgG熒光二抗和TritonX-100則分別購自Moleculor Probe公司和Sigma公司。其他常用試劑均屬于國產(chǎn)或進(jìn)口的分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 pCEP4-PDGF-GAP-43重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

從成年的C57小鼠中提取RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA的第一條鏈，PCR大量擴增后得到目的基因GAP-43，采用KpnI/XhoI進(jìn)行雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳回收純化目的片段697 bp連入線性化載體pCEP4-PDGF，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌E.Coli DH5α后，接種LB平板，挑取單菌落擴增后提取pCEP4-PDGF-GAP-43重組質(zhì)粒。KpnI/XhoI雙酶切鑒定后，送測序分析。

1.2.2 GAP-43轉(zhuǎn)基因小鼠的制備

選取7～8周齡雌性C57BL/6J小鼠作為供體，與同種雄鼠合籠;另取數(shù)只2月齡以上的母鼠作為受體，與經(jīng)過輸精管結(jié)扎的雄鼠合籠，形成假孕母鼠。有精栓者手術(shù)取出輸卵管，進(jìn)而取出受精卵，培養(yǎng)后用注射針把轉(zhuǎn)基因載體分別移入受精卵，然后將卵巢連同輸卵管放回供體鼠腹腔。

1.2.3 GAP-43轉(zhuǎn)基因小鼠的檢測

1)PCR鑒定GAP-43高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的基因型:新生鼠2周齡時取尾部組織(約5 mm)常規(guī)方法提取組織DNA，用PCR對GAP-43片段進(jìn)行檢測;選取檢測陽性的小鼠與C57BL/6J小鼠交配傳代，子代經(jīng)同法檢測并再傳代。正向引物序列為5'-GATGCTCCCGTTGCTGAT-3'，反向引物序列為 5'-CCTTAGGTTTGGCTTCGTC-3';反應(yīng)體系與擴增程序按照94℃變性30 s、58℃退火30 s和72℃延伸30 s的過程進(jìn)行35個循環(huán)實施。

2)蛋白免疫印跡檢測GAP-43的表達(dá):在4℃條件下，在4周齡鼠腦中加入裂解液提取GAP-43蛋白，用BCA Protein Assay Kit測定樣品蛋白含量。每個樣本取10 μg蛋白進(jìn)行SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜上，5% 脫脂奶粉封閉液，室溫下置搖床上封閉1 h，再用TBST稀釋的羊抗小鼠源重組的GAP-43單克隆抗體(1∶3 000稀釋)，4℃ 搖床雜交過夜;待恢復(fù)室溫后，TBST洗3次，每次10 min置入 TBST稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗小鼠抗體(1∶5 000)室溫雜交1 h，洗 3 次，每次 10 min，將膜置于化學(xué)發(fā)光液中，X-Ray膠片曝光，顯影及定影。

3)組織免疫熒光檢測GAP-43的表達(dá):冰凍切片機海馬連續(xù)切片，切片厚度為40 μm，全部貼片。切片入0.01 mol/L PBST中浸洗3次(5 min/次)后，入5%正常血清+0.1%BSA混合封閉液中室溫封閉抗原;傾去血清后直接置入用0.01 mol/L PBST按1∶1 000稀釋的GAP-43的抗體和用0.01 mol/L PBST按1:500稀釋的Neun的抗體中，4℃過夜;切片再入PBST中浸洗3次(5 min/次)，后放入用0.01 mol/L PBST稀釋好的熒光二抗(1∶500)中，室溫1 h;0.01 mol/L PBS浸洗3次(5 min/次)后，用1∶3 000 的 hochest33258 染核，15 min，室溫避光;將切片最后用PBS浸洗2次(5 min/次)，70%甘油封片。共聚焦顯微鏡下觀察照相。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。GAP-43蛋白含量以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(x ±SE)表示。實驗組和對照組比較行單因素方差分析(ANOVA)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒pCEP4-PDGF-AD-GAP-43的構(gòu)建及酶切鑒定與序列分析

重組質(zhì)粒分別經(jīng)KpnⅠ/XhoⅠ雙酶切后，將目的基因GAP-43插入雙酶切位點之間(圖1)。1%瓊脂糖凝膠電泳分離均可見2個片段，酶切產(chǎn)物為684bp，與預(yù)期結(jié)果一致(圖2)。GenBank BLAST分析顯示，重組質(zhì)粒測序結(jié)果顯示目的基因與GenBank已報道的序列完全一致。

2.2 首建鼠的PCR鑒定

將帶有包裝好質(zhì)粒的受精卵植入代孕母鼠后，分娩得到19只F1代小鼠，PCR鑒定如圖3所示。結(jié)果顯示GAP-43基因片段已經(jīng)成功插入小鼠的基因組內(nèi)，經(jīng)測序后驗證基因序列與原序列吻合，并得到9只首建GAP-43高表達(dá)小鼠。

圖3 GAP-43基因高表達(dá)F1代轉(zhuǎn)基因小鼠PCR檢測結(jié)果Fig.3 PCR results of F1 transgenic mice with high expression of GAP-43

2.3 蛋白免疫印跡檢測GAP-43的表達(dá)

4周齡轉(zhuǎn)基因組的小鼠海馬中GAP-43蛋白的表達(dá)量高于對照組的同胞小鼠(圖4)。

圖4 Western blotting法檢測GAP-43蛋白在海馬的表達(dá)Fig.4 Determination of expression of GAP-43 protein by Western blotting in the hippocampus in normal and transgenic mice

2.4 組織免疫熒光檢測GAP-43的表達(dá)位置

共聚焦顯微鏡觀察P28齡高表達(dá)GAP-43轉(zhuǎn)基因陽性小鼠腦區(qū)免疫熒光染色切片，可見GAP-43陽性反應(yīng)物彌散分布于大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)且特異性存在于神經(jīng)元中(圖5)。

圖5 免疫熒光技術(shù)顯示GAP-43的表達(dá)Fig.5 Photomicrographs showing a comparison of immunofluorescence of GAP-43 in the cerebral cortex and hippocampus

3 討論

轉(zhuǎn)基因動物是指將外源基因用實驗方法插入動物生殖細(xì)胞的基因組而獲得的具有插入基因特性并能正常繁衍的動物［9-11］。眾所周知，GAP-43在神經(jīng)系統(tǒng)參與的生理和病理過程，在體實驗多選用GAP-43基因敲除小鼠為研究的基礎(chǔ)模型，但是GAP-43在體內(nèi)缺失后，并不能完全屏蔽其作用。近年來研究［8］發(fā)現(xiàn)，GAP-43基因敲除小鼠發(fā)育正常，基本生理和認(rèn)知功能未受到明顯影響。相反，對高表達(dá)GAP-43基因小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表現(xiàn)卻研究很少。鑒于人們已經(jīng)關(guān)注到GAP-43基因與中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育相關(guān)［3，12］，因此，培育 GAP-43 高表達(dá)的轉(zhuǎn)基因小鼠就有了重要的價值。

本實驗以GAP-43為靶基因，成功構(gòu)建了攜帶神經(jīng)系統(tǒng)特異性啟動子的pCEP4-PDGF打靶載體，通過顯微注射技術(shù)建立了GAP-43高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠。獲得9只F0代轉(zhuǎn)基因小鼠，將這些小鼠與C57BL/6J野生型小鼠交配產(chǎn)生F1代轉(zhuǎn)基因小鼠。PCR結(jié)果顯示GAP-43基因片段已經(jīng)成功的插入小鼠的基因組內(nèi)。PCR技術(shù)簡單、快捷，通過對轉(zhuǎn)入基因片段的擴增來檢測動物的轉(zhuǎn)基因事件，已被廣泛用于轉(zhuǎn)基因動物基因整合、表達(dá)的檢測，但當(dāng)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)較低或者與所轉(zhuǎn)動物同源性較高時容易出現(xiàn)假陽性［13］。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動物關(guān)鍵在于外源蛋白是否表達(dá)，表達(dá)的蛋白質(zhì)是否具有活性。目前蛋白質(zhì)水平的檢測方法主要有Western印跡法(Western blotting)和酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme linked immunos orbent assay，ELISA)。因為GAP-43 mRNA在海馬區(qū)保持較高水平，而GAP-43蛋白的表達(dá)水平與GAP-43 mRNA的水平有很大的相關(guān)性，本研究取材4周齡小鼠海馬區(qū)用于蛋白免疫印跡［14］。研究結(jié)果顯示GAP-43高表達(dá)轉(zhuǎn)基因組的小鼠，其GAP-43蛋白的表達(dá)量高于同胞對照組的小鼠且差異有統(tǒng)計學(xué)意義。正常大鼠腦內(nèi)許多區(qū)域有GAP-43免疫組化反應(yīng)陽性物:在大腦，陽性物彌散分布于皮質(zhì)中，在邊緣系統(tǒng)和聯(lián)合區(qū)，包括與突觸可塑性相關(guān)的一些區(qū)域如海馬，GAP-43呈持續(xù)高水平表達(dá)［15］。為了進(jìn)一步檢測GAP-43高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的GAP-43蛋白表達(dá)位置，我們又采用了免疫熒光化學(xué)的方法，研究結(jié)果顯示，GAP-43陽性反應(yīng)物彌散分布于大腦皮質(zhì)和海馬中，且特異性存在于神經(jīng)元中。GAP-43基因敲除小鼠在神經(jīng)發(fā)育過程中不能表達(dá)GAP-43，因此，干擾了神經(jīng)前體細(xì)胞分化為神經(jīng)元的這一過程，從而導(dǎo)致神經(jīng)元的數(shù)量減少，但其中的機制并不清楚［8］。本研究建立了GAP-43高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠，初步觀察到小鼠的運動能力較野生型小鼠有所增強，這是否是由于神經(jīng)元的數(shù)量改變所引起有待于進(jìn)一步的研究。綜上所述，本研究通過顯微注射法使外源基因GAP-43在小鼠基因組中整合并在子代小鼠中穩(wěn)定遺傳，并且在成年鼠的海馬區(qū)高表達(dá)，即GAP-43高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠在轉(zhuǎn)錄水平及表達(dá)水平建立成功。

過去認(rèn)為，GAP-43只在成熟的神經(jīng)元表達(dá)，在神經(jīng)元軸突的再生和突觸可塑性方面發(fā)揮重要功能［3，16］?，F(xiàn)在人們對GAP-43有了新認(rèn)識，發(fā)現(xiàn)GAP-43在神經(jīng)發(fā)生早期就有表達(dá)，當(dāng)GAP-43缺失時，神經(jīng)發(fā)生就會被抑制［17-19］。體內(nèi)研究［20］表明，當(dāng) GAP-43缺失時，神經(jīng)前體細(xì)胞增生受抑制，未成熟神經(jīng)元凋亡，星形膠質(zhì)細(xì)胞分化受抑制。然而，人們對GAP-43蛋白的這些功能的機制卻遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有認(rèn)識清楚。因此，GAP-43高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠的成功建立應(yīng)該為深入研究GAP-43在神經(jīng)損傷修復(fù)及神經(jīng)發(fā)育中的作用提供有力的動物模型基礎(chǔ)。

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