許曉巖 楊媛華 翟振國(guó) 龐寶森 王 辰

(1.首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院北京呼吸疾病研究所，北京100020;3.衛(wèi)生部北京醫(yī)院北京呼吸疾病研究所，北京100730)

肺血栓栓塞癥(pulmonary thromboembolism，PTE)和下肢深靜脈血栓形成(deep venous thrombosis，DVT)是靜脈血栓癥(venous thromboembolism，VTE)的2個(gè)不同階段。目前認(rèn)為VTE是由于遺傳和(或)環(huán)境異常造成的一種多基因、多因素疾病。其中凝血系統(tǒng)基因多態(tài)性是研究方向之一。凝血因子ⅩⅢ，簡(jiǎn)稱(chēng)因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)基因單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNP)與疾病關(guān)系的研究［1-5］顯示，A 亞基 Val34Leu(100G/T)多態(tài)性中突變等位基因T可能對(duì)心腦血管疾病和VTE具有保護(hù)作用，但我國(guó)對(duì)此的研究資料有限。關(guān)于B亞基His95Arg(8259A/G)多態(tài)性的資料不多，有研究［6］顯示其突變等位基因 G可能與 A亞基Val34Leu多態(tài)性中的T等位基因有協(xié)同作用，顯著降低心肌梗死的危險(xiǎn)，但據(jù)報(bào)道［7］，此突變會(huì)增加DVT的風(fēng)險(xiǎn)，未見(jiàn)其與PTE關(guān)系的報(bào)道，中國(guó)人中更未見(jiàn)該多態(tài)性的研究。本研究利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)－限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(restricted fragment length polymorphisms，RFLP)技術(shù)，在中國(guó)漢族人群中對(duì)FⅩⅢ A亞基 Val34Leu和 B亞基His95Arg多態(tài)性與PTE的關(guān)系進(jìn)行探討。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象

采用病例－對(duì)照研究。病例組來(lái)自2002年6月到2007年2月在首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京朝陽(yáng)醫(yī)院呼吸科確診的PTE患者114例。所有病例均按照中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì)制定的《肺血栓栓塞癥的診斷與治療指南(草案)》［8］的標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)核素肺通氣/灌注掃描(V/Q)高度可能和/或螺旋CT肺動(dòng)脈造影(computed tomography pulmonary angiography，CTPA)見(jiàn)血栓直接征象確診PTE。對(duì)照組為與PTE患者1∶1配對(duì)的114例健康對(duì)照。對(duì)照組與PTE患者同為漢族，性別相同，年齡近似(±2歲)，既往無(wú)DVT、PTE病史，與PTE患者無(wú)血緣關(guān)系，無(wú)心、腦、肺、腎、血液、內(nèi)分泌系統(tǒng)疾病。主要來(lái)自門(mén)診體檢者和健康志愿者。對(duì)研究對(duì)象遵守醫(yī)學(xué)倫理學(xué)的一般原則。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1)標(biāo)本采集:采空腹靜脈血4 mL，EDTA抗凝。

2)DNA制備:采用低滲溶血法從新鮮全血中分離白細(xì)胞。采用酚－氯仿－異戊醇法提取DNA，用滅菌純水調(diào)整DNA濃度在0.1 μg/μL左右，－20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3)FⅩⅢ A亞基 Val34Leu基因多態(tài)性:采用PCR-RFLP聯(lián)合聚丙烯胺凝膠電泳(PAGE)檢測(cè)FⅩⅢ A亞基Val34Leu多態(tài)性。

參照文獻(xiàn)［9］的引物。引物1:5'-CATGCCTTTTCTGTTGTCTTC-3';引物 2:5'-TACCTTGCAGGTTGACGCCCCGGGGCACTA-3'，其中引物2將3'端第二個(gè)堿基由胞嘧啶(C)換成了胸腺嘧啶(T)，從而引入了一個(gè)限制性?xún)?nèi)切酶DdeⅠ的酶切位點(diǎn)。在基因文庫(kù)(GenBank)中進(jìn)行核對(duì)并尋找相應(yīng)序列。在eppendorf梯度核酸擴(kuò)增儀進(jìn)行熱循環(huán)。25 μL PCR反應(yīng)體系:樣品DNA(0.1 μg/ μL)1.0 μL，dNTP 混合物(各 2.5 mmol/L)2.0 μL，引物(50 mmol/L)各 0.2 μL，Ex Taq DNA 聚合酶(大連寶生物工程公司，5U/ μL)0.2 μL，10×反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)2.5 μL，滅菌雙蒸水 18.9 μL。PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 2 min;變性95℃ 30 s，復(fù)性58℃45 s，延伸72℃ 30 s，循環(huán)35次;后延伸:72℃ 5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

取 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 8 μL，限制性?xún)?nèi)切酶 DdeⅠ1 μL(紐英倫生物技術(shù)有限公司，10U)，緩沖液1 μL，制成混合物，37℃水浴4 h。12%PAGE，分析酶切產(chǎn)物。

4)FⅩⅢ B亞基 His95Arg基因多態(tài)性:采用PCR-RFLP聯(lián)合瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)FⅩⅢ B亞基His95Arg多態(tài)性。

參照Reiner等［6］設(shè)計(jì)的引物。引物1:5'-AAAGACAAGCTTAGTTTCATCATT-3';引物2:5'-TCTTCAGTTTAGGAAATGATTCTTAT-3'。在基因文庫(kù)(GenBank)中進(jìn)行核對(duì)并尋找相應(yīng)序列。在eppendorf梯度核酸擴(kuò)增儀進(jìn)行熱循環(huán)。25 μL PCR反應(yīng)體系:樣品DNA(0.1 μg/ μL)1.0 μL，dNTP 混合物(各 2.5 mmol/L)2.0 μL，引物(50 mmol/L)各 0.2 μL，Ex Taq DNA 聚合酶(大連寶生物工程公司，5U/ μL)0.2 μL，10×反應(yīng)緩沖液(含Mg2+)2.5 μL，滅菌雙蒸水 18.9 μL。PCR 反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃ 2 min;變性95℃ 30 s，復(fù)性58℃30 s，延伸72℃ 30 s，循環(huán)35次;后延伸:72℃ 5 min。2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產(chǎn)物。

取 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 8 μL，限制性?xún)?nèi)切酶 NsiⅠ1 μL(紐英倫生物技術(shù)有限公司，10U)，緩沖液1 μL，制成混合物，37℃水浴4 h。2% 瓊脂糖凝膠電泳分析酶切產(chǎn)物。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù)并進(jìn)行數(shù)據(jù)整理與分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，計(jì)數(shù)資料以構(gòu)成比或率表示?；蝾l率采用基因計(jì)數(shù)法計(jì)算，基因型分布是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律及兩組間等位基因頻率的差異比較采用χ2檢驗(yàn);兩組間計(jì)算比數(shù)比(OR)和95%的可信區(qū)間(CI)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PTE組和對(duì)照組的基本情況

PTE組和對(duì)照組各114例，其中每組男性70例，女性44例。2組平均年齡均為55歲(表1)。

表1 PTE組和對(duì)照組基本情況比較Tab.1 The age and sex of PTE patients and 114 healthy controls

2.2 FⅩⅢ基因多態(tài)性的PCR產(chǎn)物及酶切結(jié)果分析

1)FⅩⅢA亞基Val34Leu多態(tài)性:PCR擴(kuò)增出1條含F(xiàn)ⅩⅢ A亞基Val34Leu多態(tài)性位點(diǎn)的DNA片段，長(zhǎng)192 bp(圖1)。經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶DdeⅠ酶切后，野生型(GG)沒(méi)有酶切位點(diǎn)，不被切割，仍為192bp 1個(gè)片段;雜合型(GT)呈192bp、161bp和31bp 3個(gè)片段;未見(jiàn)突變型(TT)。由于31bp片段短，不易觀察，故主要區(qū)分192bp和161bp 2個(gè)片段(圖2)。

2)FⅩⅢB亞基His95Arg多態(tài)性:PCR擴(kuò)增出1條含F(xiàn)ⅩⅢB亞基His95Arg多態(tài)性位點(diǎn)的DNA片段，長(zhǎng)264bp(圖3)。經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶NsiⅠ酶切后，野生型(AA)呈129bp和135bp 2個(gè)片段;雜合型(AG)呈264bp、129bp和135bp 3個(gè)片段;未見(jiàn)突變型(GG)。由于129 bp和135bp 2個(gè)片段僅相差6個(gè)bp，2%的瓊脂糖凝膠電泳不能區(qū)分，僅呈1條條帶(圖4)。

圖1 PCR擴(kuò)增出一條含F(xiàn)ⅩⅢA亞基Val34Leu多態(tài)性位點(diǎn)的DNA片段，長(zhǎng)192 bpFig.1 The polymerase chain reaction(PCR)was used to amplify a 192-bp fragment from the factorⅩⅢA subunit gene

圖4 經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶NsiⅠ酶切后Fig.4 The PCR product was digested with Nsi I

2.3 PTE組和對(duì)照組間FⅩⅢ基因多態(tài)性比較

1)FⅩⅢA亞基Val34Leu多態(tài)性:PTE組和對(duì)照組均未檢測(cè)到突變純合子(TT)，并且 GG和 GT基因型在2組中分布相同，GG型113(99.1%)，GT型1(0.9%)，等位基因G和T的頻率分別0.996，0.004(表2)?；蛐头植季螲ardy-Weinberg平衡。

2)FⅩⅢ B亞基His95Arg多態(tài)性:PTE組，F(xiàn)ⅩⅢB亞基His95Arg多態(tài)性AA、AG、GG基因型的分布頻數(shù)分別為111(97.4%)、3(2.6%)、0(0);等位基因A和G的頻率分別0.987，0.013。對(duì)照組 AA、AG、GG基因型的分布頻數(shù)分別為104(91.2%)、10(8.8%)、0(0)。等位基因A和G的頻率分別0.956，0.044。對(duì)2組不同基因型實(shí)際頻數(shù)和期望頻數(shù)分別做χ2檢驗(yàn)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，基因型分布均符合 Hardy-Weinberg平衡。2組均未檢測(cè)到突變純合子(GG)。2組間基因型的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.997，P=0.046)。2組間等位基因的分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.880，P=0.049)，PTE 組 G 等位基因分布顯著低于對(duì)照組(表3)。相對(duì)于AA基因型而言，AG基因型有減低 PTE發(fā)生危險(xiǎn)的趨勢(shì)(OR=0.281，P=0.046)。

表2 FⅩⅢA亞基Val34Leu多態(tài)性基因型頻率和等位基因頻率Tab.2 FⅩⅢ A Val34Leu(100G/T)polymorphisms n(%)

表3 FⅩⅢB亞基His95Arg多態(tài)性基因型頻率和等位基因頻率Tab.3 FⅩⅢ B His95Arg(8259A/G)polymorphisms n(%)

3 討論

凝血因子ⅩⅢ，簡(jiǎn)稱(chēng)因子ⅩⅢ(FⅩⅢ)是機(jī)體凝血瀑布反應(yīng)的最后一個(gè)酶，又稱(chēng)纖維蛋白穩(wěn)定因子。血漿中的FⅩⅢ 以酶原形式存在，呈四聚體結(jié)構(gòu)(A2B2)，即2個(gè)A亞基和2個(gè)B亞基組成，其中A亞基具有轉(zhuǎn)谷氨酸酶活性，B亞基起載體作用。血漿中的FⅩⅢ活化為FⅩⅢa需要2步，第1步為凝血酶裂解A亞基精氨酸(Arg)37－甘氨酸(Gly)38鍵;第2步為B亞基從A亞基分離，使A亞基的半胱氨酸活性位點(diǎn)暴露。

FⅩⅢ A亞基 Val34Leu(100G/T)多態(tài)性與FⅩⅢB亞基His95Arg(8259A/G)多態(tài)性位于編碼區(qū)，造成了氨基酸的置換，可能影響了FⅩⅢ 的活化，進(jìn)一步影響纖維蛋白凝塊的結(jié)構(gòu)及穩(wěn)定性［10］。

FⅩⅢ A亞基 Val34Leu(100G/T)多態(tài)性是指F13A基因的2號(hào)外顯子發(fā)生G→T的點(diǎn)突變，使34號(hào)密碼子所編碼的氨基酸由纈氨酸變?yōu)榱涟彼?Val34Leu)。這一多態(tài)性位點(diǎn)距凝血酶對(duì)FⅩⅢ 的活化部位僅3個(gè)氨基酸。現(xiàn)有的研究發(fā)現(xiàn)這一突變不影響FⅩⅢ的血漿水平，但使凝血酶對(duì)FⅩⅢ 的活化速度，在34Leu明顯快于野生型34Val，使纖維蛋白較快發(fā)生交聯(lián)，從而使血小板黏附下降，終止凝血過(guò)程，導(dǎo)致纖維蛋白凝塊結(jié)構(gòu)改變，穩(wěn)定性下降［11-15］。關(guān)于FⅩⅢA亞基Val34Leu多態(tài)性與VTE的關(guān)系國(guó)外有多篇報(bào)道。但對(duì)于T等位基因是否對(duì)VTE有保護(hù)作用，所得出的結(jié)論不一。2項(xiàng)Meta分析研究［4-5］中關(guān)于該多態(tài)性位點(diǎn)與VTE關(guān)系的研究，認(rèn)為T(mén)等位基因?qū)TE起保護(hù)作用。另外，文獻(xiàn)［16］報(bào)道FⅩⅢA亞基Val34Leu多態(tài)性存在明顯的種族差異。這一多態(tài)性在美洲印第安人最高(51.2%)，西方白色人種次之(44.3%)，黑色人種也較常見(jiàn)(28.9%)，而在日本人中最低(2.5%)。

我們的研究?jī)H在PTE組和對(duì)照組中各檢測(cè)到1例FⅩⅢA亞基Val34Leu突變雜合子，即GT基因型，2組中基因型分布及等位基因頻率相同。T等位基因在中國(guó)漢族人群中少見(jiàn)，基因頻率為0.004，與以往的研究［17］相符。說(shuō)明FⅩⅢ A亞基Val34Leu多態(tài)性可能對(duì)中國(guó)漢族人群PTE的發(fā)生影響很小;也進(jìn)一步體現(xiàn)了基因多態(tài)性的地區(qū)和種族差異。說(shuō)明盡管生活環(huán)境、習(xí)慣及其他因素在疾病的發(fā)生過(guò)程中起著重要作用，但不同種族在遺傳背景上的差異也是導(dǎo)致疾病易感性不同以及臨床表現(xiàn)不盡相同的一個(gè)重要因素。

FⅩⅢB亞基His95Arg(8259A/G)多態(tài)性是指F13B基因8259位點(diǎn)A→G突變，該突變位于3號(hào)外顯子上，導(dǎo)致FⅩⅢB亞基95位組氨酸(His)被精氨酸(Arg)替代。3號(hào)外顯子編碼FⅩⅢ B亞基的第2個(gè)Sushi域，該域參與 A、B亞基的結(jié)合。Komanasin等［7］在 Leeds(214 例患者－116 例 DVT、98 例 PTE，247例對(duì)照)和LETS(471例DVT，472例對(duì)照)兩項(xiàng)病例對(duì)照研究中探討FⅩⅢ B亞基His95Arg多態(tài)性與VTE的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)突變雜合子AG增加VTE的危險(xiǎn)，OR值(95%CI)分別為1.6(1.0～2.6)和1.4(1.0～2.0)。Reiner等［6］一項(xiàng)關(guān)于女性心肌梗死(MI)發(fā)生危險(xiǎn)性的研究，未發(fā)現(xiàn)FⅩⅢ B亞基His95Arg多態(tài)性與MI相關(guān)，但G等位基因與FⅩⅢA亞基Val34Leu多態(tài)性中的T等位基因有協(xié)同作用，在T等位基因攜帶者中，G等位基因顯著降低MI的危險(xiǎn)，并能降低雌激素替代治療者發(fā)生MI的危險(xiǎn)。

本研究首次在中國(guó)漢族人群中探討FⅩⅢB亞基His95Arg多態(tài)性，PTE組和對(duì)照組均未發(fā)現(xiàn)突變純合子(GG)。對(duì)照組 AA、AG基因型分別為 104(91.2%)、10(8.8%)，PTE 組 AA、AG 基因型分別為111(97.4%)、3(2.6%)，AG基因型在PTE組檢出較少(P=0.046)，相對(duì)于AA基因型而言，AG基因型有減低PTE發(fā)生危險(xiǎn)的趨勢(shì)(OR=0.281)，但95%CI在0.075～1.050，進(jìn)一步增大樣本量，有望得到陽(yáng)性結(jié)果。這與Komanasin等［7］得出的結(jié)論不符，考慮可能與疾病類(lèi)型及人種、地區(qū)不同有關(guān)。對(duì)于FⅩⅢ B亞基His95Arg多態(tài)性的研究資料有限，有待更多的研究闡述其與血栓性疾病的關(guān)系。

中國(guó)漢族人群中，F(xiàn)ⅩⅢ A亞基Val34Leu(100C/T)多態(tài)性少見(jiàn)，該多態(tài)性可能對(duì)中國(guó)漢族人群PTE的發(fā)生影響很小。中國(guó)人群中存在FⅩⅢ B亞基His95Arg(8259A/G)多態(tài)性。健康對(duì)照組中AA、AG、GG 3種基因型的分布為104(91.2%)、10(8.8%)、0(0)，G等位基因的頻率為0.044?；蛐头植季螲ardy-Weinberg平衡。突變雜合子AG基因型有減低PTE發(fā)生危險(xiǎn)的趨勢(shì)。

［1］Voetsch B，Loscalzo J.Genentic determinants of artierial thrombosis［J］.Thromb Vasc Biol，2004，24:226-229.

［2］Voko Z，Bereczky Z，Katona E，et al.FactorⅩⅢ Val34Leu variant protects against coronary artery disease:A metaanalysis［J］.Thromb Haemost，2007，97(3):458-463.

［3］Shafey M，Anderson J L，Scarvelis D，et al.FactorⅩⅢVal34Leu variant and the risk of myocardial infarction-A metaanalysis［J］.Thromb Haemost，2007，97(4):635-641.

［4］Wells P S，Anderson J L，Scarvelis D K，et al.FactorⅩⅢVal34Leu variant is protective against venous thromboembolism:a HuGE review and Meta-Analysis［J］.Am J Epidemiol，2006，164(2):101-109.

［5］Gohil R，Peck G，Sharma P.The genetics of venous thromboembolism.A meta-analysis involving approximately 120，000 cases and 180，000 controls［J］.Thromb Haemost，2009，102(2):360-370.

［6］Reiner A P，Heckbert S R，Vos H L，et al.Genetic variants of coagulation factorⅩⅢ，postmenopausal estrogen therapy，and risk of nonfatal myocardial infarction［J］.Blood，2003，102(1):25-30.

［7］Komanasin N，Catto A J，F(xiàn)uters T S，et al.A novel polymorphism in the factorⅩⅢ B-subunit(His95Arg):relationship to subunit dissociation and venous thrombosis［J］.J Thromb haemost，2005，3(11):2487-2496.

［8］中華醫(yī)學(xué)會(huì)呼吸病學(xué)分會(huì).肺血栓栓塞癥的診斷與治療指南(草案)［J］.中華結(jié)核和呼吸雜志，2001，24:259-264.

［9］Kangsadalampai S， Board P G. The Val34Leu polymorphism in the a subunit of coagulation factorⅩⅢcontributes to the large normal range in activity and demonstrates that the activation peptide plays a role in catalytic activity［J］.Blood，1998，92(8):2766-2770.

［10］ScottE M， Ariёns R， GrantP J. Genetic and Environmental Determinants of Fibrin Structure and Function:Relevance to Clinical Disease［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2004，24(19):1558-1566.

［11］Balogh I，Szoke G，Karpati L，et al.Val34Leu polymorphism of plasma factor Ⅹ Ⅲ:biochemistry and epidemiology in familial thrombophilia［J］.Blood，2000，96(17):2479-2486.

［12］Ariens R A，Philippou H，Nagaswami C，et al.The factorⅩⅢV34L polymorphism accelerates thrombin activation of factorⅩⅢ and affects cross-linked fibrin structure［J］.Blood，2000，96(3):988-995.

［13］Ariens R A，Lai T S，Weisel J W，et al.Role of factorⅩⅢin fibrin clot formation and effects of genetic polymorphisms［J］.Blood，2002，100(3):743-754.

［14］Shemirani A H，Haramura G，Bagoly Z，et al.The combined effect of fibrin formation and factorⅩⅢ A subunit Val34Leu polymorphism on the activation of factorⅩⅢ in whole plasma［J］.Biochim Biophys Acta，2006，1764(8):1420-1423.

［15］Bagoly Z，Koncz Z，Hársfalvi J，et al.FactorⅩⅢ，clot structure，thrombosis［J］.Thromb Res，2012，129(3):382-387.

［16］Attié-Castro FA，Zago M A，Lavinha J，et al.Ethnic heterogeneity of the factorⅩⅢ Val34Leu polymorphism［J］.Thromb Haemost，2000，84(4):601-603.

［17］鄭紅，賀穎，連建華，等.深靜脈血栓形成患者凝血因子III Val34Leu基因多態(tài)性檢測(cè)［J］.鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2006，41(2):280-282.