肖 黎，王亞軍，曹 政，柳志強(qiáng)，鄭裕國

(浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所生物轉(zhuǎn)化與生物凈化教育部工程研究中心，杭州 310014)

阿托伐他汀鈣對(duì)膽固醇合成的關(guān)鍵限速酶3-羥基-3-甲基輔酶A(HMG-CoA)還原酶具有強(qiáng)烈的抑制作用，可抑制膽固醇的合成，是治療心血管疾病的重要藥物［1-2］。6-氰基 -(3R，5R)-二羥基己酸叔丁酯((3R，5R)-2)是阿托伐他汀鈣的雙手性藥效基團(tuán)、關(guān)鍵手性合成砌塊［3］。傳統(tǒng)的(3R，5R)-2化學(xué)合成法需要深冷條件(反應(yīng)溫度低于-60℃)，且反應(yīng)副產(chǎn)物多、產(chǎn)物光學(xué)純度低，還存在能量和溶劑消耗大等缺陷［4］。理論上，利用氧化還原酶不對(duì)稱還原6-氰基-(5R)-羥基-3-羰基己酸叔丁酯((5R)-1)合成(3R，5R)-2具有環(huán)境友好、條件溫和、立體選擇性高等技術(shù)優(yōu)勢(shì)。

在氧化還原過程中，輔酶高效循環(huán)十分重要［5-6］，Ni等［7］利用 FabG(Bacillus sp.ECU0013)與葡萄糖脫氫酶(GDH)的共表達(dá)菌株選擇性還原2-氧代-4-苯基丁酸乙酯合成(S)-4-苯基-2-羥基丁酸乙酯，發(fā)現(xiàn)最高底物濃度可達(dá)到620.0 g/L，e.e.值大于99%。共表達(dá)菌株自身含有高效的輔酶再生系統(tǒng)，可解決雙菌耦聯(lián)傳質(zhì)限制問題［8-10］，且反應(yīng)操作簡(jiǎn)便?；诒菊n題組前期的菌種選育工作［11］，成功構(gòu)建了羰基還原酶與葡萄糖脫氫酶共表達(dá)菌株E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X，筆者將優(yōu)化 E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X全細(xì)胞不對(duì)稱還原(5R)-1制備(3R，5R)-2，其反應(yīng)過程見圖1。

圖1 共表達(dá)菌株E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X不對(duì)稱還原(5R)-1制備(3R，5R)-2Fig.1 Scheme for(3R，5R)-2 synthesis through asymmetric reduction of(5R)-1 with E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X

1 材料與方法

1.1 菌株

E.coli BL21/pET28a-cr-X 與 E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X由浙江工業(yè)大學(xué)生物工程研究所構(gòu)建、保藏。

1.2 培養(yǎng)基組成

斜面培養(yǎng)基組成(g/L):蛋白胨10.0，酵母粉5.0，NaCl 10.0，瓊脂 20.0。

LB培養(yǎng)基(g/L):胰蛋白胨10.0、酵母粉5.0、NaCl 10.0。E.coli BL21/pET28a-cr-X 培養(yǎng)基滅菌后加入 30 μg/mL 卡那霉素，E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X培養(yǎng)基滅菌后加入終質(zhì)量濃度50 μg/mL鏈霉素。

1.3 主要試劑

鏈霉素、卡那霉素、IPTG等試劑，購自TaKaRa公司;NADP+、NADPH，由百靈威公司提供;(3R，5R)-2，購自Toronto化學(xué)制品研究公司;(5R)-1(含量73.5%)，由浙江新東港藥業(yè)股份有限公司饋贈(zèng)。胰蛋白胨和酵母粉，購自O(shè)xoid公司;其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 培養(yǎng)方法

種子液制備:從斜面培養(yǎng)基中挑取1接種環(huán)的菌落接種于裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于旋轉(zhuǎn)式搖床(37℃、180 r/min)培養(yǎng)10 h。

發(fā)酵培養(yǎng):按體積分?jǐn)?shù)5.0%的接種量接種于裝有100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于搖床(37℃、180 r/min)培養(yǎng)2 h后至OD600為0.8左右，加入IPTG誘導(dǎo)劑28℃誘導(dǎo)。

1.5 粗酶液制備及酶活測(cè)定

發(fā)酵液9000 r/min、4℃離心5 min收集菌體，生理鹽水(質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.85%)洗滌菌泥2次，利用100 mmol/L、pH 7.0 K2HPO4-KH2PO4緩沖液分散菌體，超聲波破碎20 min(400 W，工作1 s，停頓1 s)。細(xì)胞破碎液4℃高速離心5 min，收集上清液用于羰基還原酶與葡萄糖脫氫酶酶活的測(cè)定。

在30℃、pH 7.0條件下，每分鐘氧化1 μmol NADPH所需的酶量定義為1個(gè)羰基還原酶(CRX)酶活單位。相同條件下，每分鐘生成 l μmol NADPH所需的酶量定義為1個(gè)葡萄糖脫氫酶(GDH)酶活單位。

1.6 E.coli BL21/pET28a-cr-X、E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X全細(xì)胞催化制備(3R，5R)-2

發(fā)酵液9000 r/min、4℃離心5 min，收集菌體，菌泥采用生理鹽水(0.85%)洗滌2次后用于生物催化反應(yīng)。反應(yīng)體系選擇20.0 mL 100 mmol/L KH2PO4-K2HPO4緩沖液，葡萄糖與底物以質(zhì)量比1∶1添加，菌體質(zhì)量濃度 9.70 g/L，380 r/min轉(zhuǎn)化，催化過程中保持pH恒定在7.0左右，定時(shí)取樣。試樣用無水乙醇稀釋，離心，上清液采用高效液相色譜分析檢測(cè)。

分別利用 E.coli BL21/pET28a-cr-X與 E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X全細(xì)胞催化合成(3R，5R)-2，并考察生物催化劑采用E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X全細(xì)胞時(shí)，葡萄糖濃度、pH、溫度、底物濃度、NADP+、菌體濃度對(duì)(5R)-1轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)物(3R，5R)-2 d.e.值的影響。

1.7 分析方法

(5R)-1、(3R，5R)-2及其差向異構(gòu)體采用島津HPLC LC-20AD檢測(cè)，色譜柱選擇大連依利特Hypersil ODS2 C18柱(4.6 mm ×250 mm，2.5 μm)，流動(dòng)相為按體積比1∶3配制的乙腈水溶液，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL，檢測(cè)波長 210 nm，柱溫40℃。

產(chǎn)物(3R，5R)-2 d.e.值按式(1)計(jì)算。

式中:A(3R，5R)表示(3R，5R)-2 產(chǎn)物的峰面積;A(3S，5R)表示(3S，5R)-2 構(gòu)型產(chǎn)物的峰面積。

底物轉(zhuǎn)化率η按式(2)計(jì)算。

式中:c0表示起始底物(5R)-1濃度，mol/L;c表示反應(yīng)后(5R)-1濃度，mol/L;V0表示初始反應(yīng)液體積，L;V表示最終反應(yīng)值體積，L。

2 結(jié)果與討論

2.1 E.coli BL21/pET28a-cr-X 與 E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X全細(xì)胞催化合成(3R，5R)-2

在30℃、pH 7.0條件下，E.coli BL21/pET28a-cr-X與 E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X全細(xì)胞催化(5R)-1不對(duì)稱還原結(jié)果見表1。由表1可知，共表達(dá)菌株E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X催化效率顯著高于單一的羰基還原酶菌株E.coli BL21/pET28a-cr-X，這與葡萄糖脫氫酶參與的輔酶再生密切相關(guān)。

表1 不同菌株對(duì)(5R)-1不對(duì)稱還原的影響Table 1 Comparison of(5R)-1 asymmetric reduction efficiency between E.coli BL21/pET28a-cr-X and E.coli/pCDFDuet-gdh-cr-X

2.2 E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X 表達(dá)條件的優(yōu)化

2.2.1 生長曲線的測(cè)定

種子37℃下培養(yǎng)10 h后，按體積分?jǐn)?shù)5%的接種量接入LB發(fā)酵培養(yǎng)基中，測(cè)定菌株的生長曲線，結(jié)果如圖2所示。由圖2可知:菌株經(jīng)過2 h延遲期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，培養(yǎng)7 h菌體OD600達(dá)到5.8左右。

圖2 菌株生長曲線Fig.2 Growth curve for E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X

2.2.2 誘導(dǎo)劑IPTG添加時(shí)間

在不同生長階段分別加入終濃度為0.10 mmol/L的IPTG，28℃誘導(dǎo)10 h。誘導(dǎo)劑IPTG添加時(shí)間對(duì)酶活的影響見圖3。由圖3可知:在對(duì)數(shù)生長前期加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，菌體酶活處于較高水平，因此選擇在對(duì)數(shù)生長前期，接種后培養(yǎng)2 h(相應(yīng)OD600約0.8)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)。

圖3 IPTG添加時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig.3 Effects of inducer adding time on CR-X and GDH activities

2.2.3 IPTG用量

重組菌發(fā)酵培養(yǎng)2 h，分別加入不同濃度IPTG，28℃誘導(dǎo)10 h。IPTG用量對(duì)酶活的影響見圖4。由圖4可知:IPTG的終濃度在0.30～0.70 mmol/L范圍內(nèi)時(shí)，酶活都保持較高水平。因此，確定最適的誘導(dǎo)劑量濃度為0.50 mmol/L。

圖4 IPTG用量對(duì)酶活的影響Fig.4 Effects of IPTG concentration on CR-X and GDH activities

2.2.4 誘導(dǎo)時(shí)間

誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)酶活的影響見圖5。由圖5可知:誘導(dǎo)7～13 h都具有很高的酶活，但隨誘導(dǎo)時(shí)間延長，酶活反而降低，這可能是由于時(shí)間過長，蛋白質(zhì)部分分解所致。因此，最佳誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間為13 h。

圖5 IPTG誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)酶活的影響Fig.5 Effects of induction time on CR-X and GDH activities

2.3 E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X 催化(5R)-1不對(duì)稱還原條件的優(yōu)化

2.3.1 葡萄糖用量的影響

在50.0 g/L(5R)-1條件下，葡萄糖用量對(duì)底物轉(zhuǎn)化的影響見圖6。由圖6可知:當(dāng)葡萄糖與底物質(zhì)量比不低于1∶1時(shí)，底物可以完全轉(zhuǎn)化，且高底物濃度的葡萄糖對(duì)酶沒有明顯抑制作用。從經(jīng)濟(jì)角度考慮，選用葡萄糖與底物以質(zhì)量比為1∶1添加。

2.3.2 pH的影響

在50.0 g/L(5R)-1條件下，反應(yīng)pH對(duì)底物轉(zhuǎn)化的影響見圖7。由圖7可知:在pH 6.0～7.5范圍內(nèi)，轉(zhuǎn)化率大于99.0%，且它的光學(xué)選擇性并不受pH的影響，d.e.值大于99.5%。當(dāng)pH為7.0時(shí)，(5R)-1轉(zhuǎn)化速度最快，因此，轉(zhuǎn)化pH最終選擇7.0。

圖6 葡萄糖濃度對(duì)(5R)-1不對(duì)稱還原的影響Fig.6 Effects of glucose concentration on(5R)-1 asymmetric reduction

圖7 pH對(duì)(5R)-1不對(duì)稱還原的影響Fig.7 Effects of pH values on(5R)-1 asymmetric reduction

2.3.3 反應(yīng)溫度的影響

在80.0 g/L(5R)-1條件下，反應(yīng)溫度對(duì)底物轉(zhuǎn)化的影響見圖8。由圖8可知:溫度不影響羰基還原酶的立體選擇性，隨著溫度的升高，d.e.值始終大于99.5%，在溫度為25和28℃時(shí)，80.0 g/L的底物可以完全轉(zhuǎn)化，但25℃轉(zhuǎn)化的速度過于緩慢。因此，反應(yīng)溫度選擇28℃。

圖8 反應(yīng)溫度對(duì)(5R)-1不對(duì)稱還原的影響Fig.8 Effects of conversion temperature on(5R)-1 asymmetric reduction

2.3.4 底物濃度的影響

在菌體濃度9.70 g/L條件下，底物濃度對(duì)底物轉(zhuǎn)化的影響見圖9。由圖9可知:底物質(zhì)量濃度為80.0和100.0 g/L，反應(yīng)2 h內(nèi)，底物可以完全轉(zhuǎn)化，當(dāng)?shù)孜餄舛冗_(dá)到120.0 g/L時(shí)，隨著時(shí)間的延長，底物仍有少量殘留。同時(shí)考察100.0 mg/L的NADP+對(duì)反應(yīng)的影響，發(fā)現(xiàn)在靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程中，NADP+是否添加對(duì)反應(yīng)速率的影響不大，這可能與外源性輔酶無法通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)有關(guān)［12-13］。

2.3.5 菌體用量的影響

菌體用量會(huì)很大程度影響催化的效率及轉(zhuǎn)化率，在以上實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選用4.85、9.70、14.55 g/L的菌體濃度，用于不同底物濃度的轉(zhuǎn)化研究，結(jié)果見表2。由表2可知:提高菌體的用量，能完全轉(zhuǎn)化的底物濃度也相應(yīng)地增加。4.85 g/L菌體能在2 h內(nèi)完全催化80.0 g/L(5R)-1不對(duì)稱還原，9.70 g/L菌體可以在2 h內(nèi)完全轉(zhuǎn)化100.0 g/L底物，產(chǎn)物(3R，5R)-2 d.e.值大于99.5%。

圖9 底物濃度對(duì)(5R)-1不對(duì)稱還原的影響Fig.9 Effects of substrate concentration on(5R)-1 asymmetric reduction

表2 菌體濃度、底物濃度對(duì)(5R)-1不對(duì)稱還原的影響Table 2 Effects of E.coli/pCDFDuet-gdh-cr-X loading size and substrate concentration on(5R)-1 asymmetric reduction

3 結(jié)論

羰基還原酶、葡萄糖脫氫酶共表達(dá)菌株E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X，能差向選擇性還原(5R)-1 合成(3R，5R)-2。在28 ℃、pH 7.0、9.70 g/L菌體、葡萄糖與(5R)-1質(zhì)量比1∶1的條件下，100.0 g/L(5R)-1在2 h內(nèi)可完全被轉(zhuǎn)化成(3R，5R)-2，產(chǎn)物d.e.值大于99.5%。與野生型Pichia guilliermondii CCTCC M 2011386 相比，E.coli BL21/pCDFDuet-gdh-cr-X表現(xiàn)出優(yōu)越的活性和立體選擇性，具有重要的工業(yè)應(yīng)用前景。

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