戴曉庭，徐 剛，陳永軍，吳堅(jiān)平，楊立榮

(浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程系，杭州 310027)

手性仲醇是合成醫(yī)藥、農(nóng)藥化學(xué)品、生活用品、信息素和高質(zhì)量液晶等不可缺少的中間體，也是不對(duì)稱合成中的重要手性輔劑［1］。獲得這些光學(xué)純化合物的主要方法有不對(duì)稱合成法、化學(xué)拆分法、酶拆分法以及色譜拆分法等。其中酶法動(dòng)力學(xué)拆分(kinetic resolution，KR)因其高效、反應(yīng)條件溫和、對(duì)環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)深受人們的青睞，成為近年來的研究熱點(diǎn)［2－7］。在以往的酶催化動(dòng)力學(xué)拆分的研究中，所使用的?；w只有確定的幾種［8］，而針對(duì)供體改變對(duì)動(dòng)力學(xué)拆分影響的報(bào)道則未作系統(tǒng)的研究。

研究發(fā)現(xiàn)，共價(jià)催化是脂肪酶催化手性仲醇實(shí)現(xiàn)選擇性轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的典型機(jī)制［9－10］。共價(jià)催化的最一般形式是催化劑的親核基團(tuán)對(duì)底物中親電性的碳原子相互作用。在酶催化的轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)過程中則表現(xiàn)為(圖1):脂肪酶活性中心的具有親核性的氨基酸殘基(a 1)與?；w中的酰基部分反應(yīng)，通過氫鍵作用，形成不穩(wěn)定的四面體過渡態(tài)結(jié)構(gòu)(a 2)，當(dāng)四面體中間體結(jié)構(gòu)中離去一個(gè)醇分子后，就形成了帶有親核基團(tuán)的?；苌?a 3);接著，這種酶的?；苌镒鳛橐粋€(gè)共價(jià)中間物與被拆分的外消旋體醇起作用;?；鶑挠H核的催化劑上轉(zhuǎn)移到最終的?；荏w即外消旋體醇的特定的一個(gè)異構(gòu)體上(a 4)。

在共價(jià)中間體(a 3)形成的過程中，脂肪酶與?；w相互作用，構(gòu)象雙雙發(fā)生變化，形成了特定的空間結(jié)構(gòu)。這樣，只有與之契合的某一構(gòu)型的底物才能被催化發(fā)生酯化反應(yīng)，從而達(dá)到動(dòng)力學(xué)拆分的效果。

圖1 酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)機(jī)制Fig.1 Reaction mechanism of serine hydrolase catalyzed esterification

由圖1的機(jī)制模型可以看出，在KR過程中，?；w對(duì)酶的催化選擇性具有極大的影響，而供體中?；糠炙鸬淖饔糜葹橹匾；w中R'的結(jié)構(gòu)將影響共價(jià)中間體(a 3)的結(jié)空間構(gòu)象，從而影響到酶的催化選擇性，這也是本研究的切入點(diǎn)。

在以往的KR研究過程中，乙酸乙烯酯、乙酸異丙烯酯以及對(duì)氯苯酚乙酸酯是最為常見的酶拆分酰基供體［8］。相對(duì)于乙酸乙烯酯和乙酸異丙烯酯來說，對(duì)氯苯酚乙酸酯在仲醇的酶拆分過程中，表現(xiàn)出更快的反應(yīng)速率和更好的底物適用性［8］。所以，在本研究過程中，選擇對(duì)氯苯酚的各種酯作為供體，研究供體?；淖儗?duì)酶催化動(dòng)力學(xué)拆分選擇性的影響。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 CRL催化仲醇的KR反應(yīng)

反應(yīng)在10 mL的封閉三角瓶中進(jìn)行。典型反應(yīng)條件:2 mL溶劑(分析純，分子篩脫水后使用)，100 mmol/L仲醇(購(gòu)自百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司)，300 mmol/L酰基供體，30 mg/mL脂肪酶CRL(Candida rugosa lipase)，40℃，轉(zhuǎn)速200 r/min。間隔取樣分析。

1.2 放大的1－苯乙醇的KR反應(yīng)

反應(yīng)在100 mL的封閉三角瓶中進(jìn)行。操作條件:3.05 g 1－苯乙醇(購(gòu)自百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司)，2.39 g正戊酸對(duì)氯苯酚酯，0.5 g脂肪酶CRL，甲苯定容至80 mL，將反應(yīng)體系置于40℃、轉(zhuǎn)速200 r/min的搖床中。間隔2 h取樣分析，待?；w反應(yīng)完全后，終止反應(yīng)。過濾、濃縮后，采用正己烷與乙酸乙酯(體積比為10∶1)的展開劑進(jìn)行柱層析純化，最終可以得到純的單一構(gòu)型的產(chǎn)物。

1.3 分析條件

采用Fuli 9790型氣相色譜(溫嶺福立分析儀器有限公司)分析試樣中各組分含量，10%甲基β－環(huán)糊精手性柱。色譜條件:汽化溫度230℃，檢測(cè)溫度230℃，柱溫80℃，載氣N2流速為45 mL/min。

底物對(duì)映體過量值e.e.S=(cSS－ cSR)/(cSR+cSS)×100%，產(chǎn)物的對(duì)映體過量值 e.e.p=(cPR－cPS)/(cPR+cPS)×100%，轉(zhuǎn)化率根據(jù)底物的減少計(jì)算而得。式中cSS、cSR、cPR和 cPS分別為 S醇、R醇、R酯和S酯的含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 CRL催化1－苯乙醇在不同供體下的KR反應(yīng)

將對(duì)氯苯酚確定為酰基供體中醇的部分，并針對(duì)供體的?；糠诌M(jìn)行規(guī)律性的擴(kuò)展，制備了一系列具有不同碳原子數(shù)側(cè)鏈的?；w，并將它們用于1－苯乙醇的動(dòng)力學(xué)拆分過程，結(jié)果見表1。

表1 不同供體下1-苯乙醇的KR反應(yīng)Table 1 KR of 1-phenylethanol with different acyl donors

由表1可知:供體中?；糠值慕Y(jié)構(gòu)改變對(duì)酶催化動(dòng)力學(xué)拆分選擇性具有極大的影響。當(dāng)酰基供體醇的部分不變時(shí)，隨著酰基部碳原分子數(shù)的增加，產(chǎn)物的e.e.p值在不斷提高。當(dāng)選擇對(duì)氯苯酚丁酸酯作為供體，反應(yīng)6 h后，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到53.2%，產(chǎn)物的e.e.p值只有 87.1%，而選擇對(duì)氯苯酚戊酸酯作為供體，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)到50%，產(chǎn)物的 e.e.p值接近100%。如果酰基側(cè)鏈的碳原子數(shù)繼續(xù)增加，產(chǎn)物e.e.p值也會(huì)近于100%。因此可以得知，?；糠值慕Y(jié)構(gòu)變復(fù)雜會(huì)使得動(dòng)力學(xué)拆分過程的選擇性更高，出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因是復(fù)雜的酰基結(jié)構(gòu)會(huì)讓共價(jià)中間物的空間結(jié)構(gòu)更具特異性，對(duì)與之契合的底物空間構(gòu)象要求更嚴(yán)格，從而提高了動(dòng)力學(xué)拆分的選擇性。

2.2 CRL催化的1－苯乙醇衍生物的KR反應(yīng)

長(zhǎng)鏈有機(jī)酸的對(duì)氯苯酚酯在1－苯乙醇的KR過程中，表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能。為考察這類供體的底物適用性，選擇對(duì)氯苯酚戊酸酯作為模型供體與不同的仲醇進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果見表2。

由表2可知，對(duì)氯苯酚戊酸酯可以很好的應(yīng)用于各種仲醇的KR過程。使用對(duì)氯苯酚戊酸酯為供體時(shí)，能使各種仲醇在50%轉(zhuǎn)化率的情況下，e.e.p值保持近于100%。由表2還可以得知，底物結(jié)構(gòu)同樣會(huì)對(duì)KR過程產(chǎn)生影響。這主要體現(xiàn)在兩個(gè)方面:一是電子效應(yīng)，相同位置上的取代基，缺電子取代基的電子效應(yīng)會(huì)減慢KR的反應(yīng)速率，而且取代基的吸電子能力越強(qiáng)，反應(yīng)速率受到的影響也就越大。二是位阻效應(yīng)，在對(duì)氯苯酚戊酸酯為供體的動(dòng)力學(xué)拆分過程中，雖然位阻增大，e.e.p值沒有明顯的變化，但是反應(yīng)速率卻受到比較明顯的影響。

?

?

2.3 放大的1－苯乙醇的KR反應(yīng)結(jié)果

當(dāng)轉(zhuǎn)化率達(dá)到43%，停止反應(yīng)，減壓蒸餾后經(jīng)硅膠層析處理，得到R－1－苯乙醇正戊酸酯1.95 g。經(jīng)最終檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，所得產(chǎn)物為單一構(gòu)型，測(cè)其旋光為=69.1(c 1.00，CH2Cl2)。在此反應(yīng)中，加入的?；w與底物的摩爾比約為0.45∶1，這是因?yàn)橐ＷC反應(yīng)在結(jié)束以后，整個(gè)體系中沒有?；w的殘余，否則?；w會(huì)與產(chǎn)物在純化時(shí)，難以分離。

3 結(jié)論

通過研究酶催化轉(zhuǎn)酯化反應(yīng)的機(jī)制，明確了?；w結(jié)構(gòu)對(duì)仲醇動(dòng)力學(xué)拆分選擇性的影響，同時(shí)參考以前研究中所使用的幾種供體，選擇對(duì)氯苯酚的有機(jī)酸酯作為拆分過程中所使用的供體。在此基礎(chǔ)上，通過改變供體酰基部分的側(cè)鏈結(jié)構(gòu)，從而發(fā)現(xiàn)對(duì)氯苯酚有機(jī)酸酯供體中?；糠痔荚訑?shù)變化對(duì)1－苯乙醇動(dòng)力學(xué)拆分結(jié)果有著極大的影響，隨著側(cè)鏈碳原子數(shù)增加，產(chǎn)物的e.e.p值會(huì)不斷地提高。當(dāng)供體側(cè)鏈碳原子數(shù)大于或等于5時(shí)，1－苯乙醇轉(zhuǎn)化率達(dá)到50%時(shí)，產(chǎn)物的e.e.p值仍能保持近于100%。將對(duì)氯苯酚戊酸酯作為供體用于其他仲醇的KR時(shí)，也取得了相同的效果，實(shí)現(xiàn)了這些仲醇的高效拆分，保證了50%的轉(zhuǎn)化率以及100%的產(chǎn)物e.e.p值。這為使用長(zhǎng)鏈有機(jī)酸酯作為供體為提高仲醇動(dòng)力學(xué)拆分的效率提供了一條新思路。

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