韓 磊，陳 曦，馮進輝，吳洽慶，朱敦明

(中國科學院 天津工業(yè)生物技術研究所 工業(yè)酶國家工程實驗室，天津 300308)

酶因其高選擇性、反應溫和等特點而被逐漸地應用于綠色化工生產(chǎn)過程中。醛縮酶能立體選擇性地催化C—C鍵的形成，可作為手性分子工業(yè)合成的重要工具［1］。2－脫氧－d－核糖5－磷酸醛縮酶(2-deoxy-d-ribose 5-phosphate aldolase，DERA，EC 4.1.2.4)是目前發(fā)現(xiàn)的唯一一種乙醛依賴型的醛縮酶。在生物體內，DERA可逆地催化其天然底物乙醛和d－甘油醛－3－磷酸發(fā)生醛縮反應而生成2－脫氧－d－核糖－5磷酸，參與多種微生物的DNA代謝途徑［2］。該酶屬于I類醛縮酶，不需要輔因子，均以一個保守的賴氨酸為活性位點［3］。

DERA具有較寬的底物譜［4］。除了乙醛外，DERA還能夠以丙醛、丙酮、氟代丙酮作供體［4］。新形成的立體中心的構型完全由DERA決定并且通常是S構型。DERA是唯一一種能催化乙醛的自縮合或和醛類物質之間的交叉縮合的醛縮酶，這使其備受關注。因為供體與受體都是醛，以乙醛作供體的縮合產(chǎn)物也可作為進一步縮合的受體底物，從而在醛縮底物上引入多個手性中心，二次縮合的產(chǎn)物可以生成穩(wěn)定的半縮醛而阻止了進一步縮合［5］。該特點使它成為合成多種稀有糖和糖衍生物的有力工具。

連續(xù)縮合產(chǎn)物可以用于合成他汀類藥物(statin)的手性側鏈前體［6－9］，這一反應過程以廉價的、非手性的材料為底物，具有廣闊的應用前景。

隨著對DERA應用價值的認識不斷加深，越來越多的編碼DERA的基因(deoC)被克隆、測序和表達。這些已報道的DERA分別來源于Aeropyrum pernix(登錄號為 BAA81452，下同)［10］、Escherichia coli K12(CAA26974)［11］、Paenibacillus sp.EA001(ACT313388)［12］、Pyrobaculum aerophilum(AAL63-340)［13］，Thermococcus kodakaraensis KOD1(BAC677-08)［14］、Thermotoga maritima(AAD36625)［13］、Yersinia sp.EA015(ACN71238)［15］。然而，通常都存在可溶表達量低、穩(wěn)定性差以及活力較低的缺點。因此，得到一種高表達量、高穩(wěn)定性的、高活力的DERA就尤為重要。本研究表達、純化一種來自Staphylococcus aureus N315的 DERA(SaDERA)，并研究其相關性質。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒、菌株及主要試劑

pET－28a(+)質粒載體和E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞購自Novagen公司。FastDigest?限制性內切酶購自Fermentas公司。蛋白胨和酵母提取物均來自BD公司。Bradford蛋白濃度試劑盒購自康世紀公司?？捡R斯亮藍 R250購自 Solarbio公司。NADH購自Codexis公司。d－2－脫氧核糖－5－磷酸(DR5P)、磷酸丙糖異構酶和甘油磷酸脫氫酶混合液(GPD/TPI，來自兔肌肉組織)購自 Sigma-Aldrich公司。40%乙醛水溶液購自國藥集團。其余試劑均為市售分析純。

1.1.2 主要儀器設備

ZHWY－200D恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城公司);SW－CJ－1FD超凈工作臺(蘇凈安泰公司);APV2000高壓勻漿破碎儀(德國APV公司);RC6+高速冷凍離心機(Thermo公司)。蛋白純化及全酶相對分子質量測定均在GE公司的AKTA Purifier 10蛋白分離純化系統(tǒng)上進行。SpectraMax? M2e酶標儀購自Molecular Devices公司;microTOF－QII型質譜(MS)分析儀、數(shù)據(jù)采集軟件microTOFcontrol及數(shù)據(jù)處理軟件DataAnalysis均購自Bruker公司。

1.2 基因挖掘

1.2.1 數(shù)據(jù)庫挖掘及生物信息學分析

在美國國立生物技術信息中心(NCBI)的蛋白數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)中，以“2-deoxy-d-ribose 5-phosphate aldolase”或“deoxyribose phosphate aldolase”為檢索詞，并以“bacteria”為限定，確定候選的DERA。通過在ExPASy的ProtParam程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein)上計算候選酶的理論理化特性，排除含半胱氨酸個數(shù)較多或是奇數(shù)的(可能影響可溶性)和預測可溶性低的。通過BioEdit分析軟件(版本7.0.9)的 ClusterW 多序列比對，分析候選的DERA的保守序列，最終確定以一種來自于Staphylococcus aureus N315的DERA為研究對象(命名為SaDERA)，其氨基酸參考序列的登錄號為BAB43223。

1.2.2 密碼子優(yōu)化和基因合成

通過在線的jcat密碼子優(yōu)化程序(http://www.jcat.de)對SaDERA的原始基因序列進行了針對在E.coli中表達的密碼子優(yōu)化，然后在N端加上了His6標簽。在確定了基因兩端的限制酶識別位之后由上海旭冠生物科技發(fā)展有限公司合成。

1.3 工程菌的構建及目的酶的表達純化

1.3.1 工程菌的構建

質粒的提取、酶切、轉化、核酸凝膠電泳、基因的誘導表達及SDS－PAGE等實驗操作均按照文獻［16］進行。目的基因構建至pET－28a(+)質粒載體的NcoI和EcoR I兩酶切位點之間，轉化至E.coli BL21(DE3)超級感受態(tài)細菌中。

1.3.2 目的酶的表達純化

將工程菌接入800 mL含終濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)(200 r/min)至 OD600為 1.0時，添加終濃度為 1 mmol/L的IPTG進行誘導表達(4 h、37℃)。離心(4℃、6000 r/min、10 min)收菌，并用4℃預冷的緩沖液 A(20 mmol/L Tris-HCl、pH 8.0、500 mmol/L NaCl)洗滌菌體，－20℃保存。

以50 mL緩沖液A重懸菌體后，進行高壓勻漿破菌，離心(12000 r/min、4 ℃、15 min)除去細胞碎片。上清液(即粗酶液，簡稱CFE)在用0.22 μm的濾膜(Millipore)過濾后通過HisTrapTMFast Flow層析柱(GE Healthcare，5 mL)進行一步純化。用10%緩沖液B(含0.2 mol/L咪唑的緩沖液A)平衡柱子，上樣后用10%的緩沖液B沖洗，待紫外檢測出現(xiàn)基線時，用10% ～100%的緩沖液B進行線性洗脫(6個體積)。收集合并目的蛋白后，通過超濾管進行濃縮脫鹽并添加終體積分數(shù)為10%的甘油。過膜分裝后，于－80℃保存。

1.4 酶學性質研究

1.4.1 活性分析方法

DERA的活性測定通過GPD/TPI耦聯(lián)的方法在酶標儀上進行。DR5P在DERA催化下裂解產(chǎn)生的G3P能被GPD/TPI還原而消耗NADH，引起340 nm波長下的吸光度下降(ε =6.22 mmol－1·cm－1)。由于GPD/TPI過量，此下降速率與G3P的生成速率一致。通常，這個耦聯(lián)反應在25℃下進行，反應體系:100 mmol/L Tris－HCl緩沖液(pH 7.7)、1 mmol/L的DR5P、2 U的 GPD/TPI和0.35 mmol/L的 NADH 以及適量的SaDERA。吸光度的變化被連續(xù)檢測5 min以確定初始反應速率。1個酶活力單位(U)被定義為在上述檢測條件下，每分鐘裂解1 μmol的DR5P而生成1 μmol的G3P所需的酶量。

1.4.2 相對分子質量的測定

SaDERA的相對分子質量及其在溶液中的聚集狀態(tài)通過SDS－PAGE以及分子篩來確定。所用分子篩為Superdex 20010/300 GL(GE公司)。流動相為含有150 mmol/L NaCl的20 mmol/L磷酸緩沖液(pH 7.4)，流速為0.4 mL/min。蛋白的相對分子質量由標準蛋白的保留體積進行計算得到。標準蛋白分別為Ovalbumin(4.4×104)、Conalbumin(7.5×104)、Conalbumin(1.58 × 105)、Ferritin(4.40 × 105)、Thyroglobulin(6.69×105)。

1.4.3 最適反應條件

最適反應條件按裂解和縮合的活性分析方法來測定。對于最適反應 pH，所用緩沖體系(100 mmol/L)為NaAc－HAc(pH 4.0～6.0)、Na2HPO4－NaH2PO4(pH 6.0～7.0)、Tris－HCl(pH 7.0～9.5)和Na2CO3－NaHCO3(pH 9.5～11.0)。對于最適反應溫度，反應在25～65℃下進行。

1.4.4 動力學參數(shù)

動力學參數(shù)按裂解和縮合的活性分析方法來測定，只是DR5P選取不同濃度(0.4～8 mmol/L)。表觀動力學參數(shù)(Km和Vmax)及其誤差由SigmaPlot v12.2的線性擬合功能得到。

1.5 穩(wěn)定性分析

1.5.1 pH穩(wěn)定性

對于pH耐受性，所用緩沖體系與最適pH測定時相同。存在于不同pH緩沖液中的酶溶液(0.5 mg/mL)的酶在25℃下溫浴24 h后，測定其殘存活力。

1.5.2 熱穩(wěn)定性

對于溫度耐受性，存在于100 mmol/L Tris－HCl緩沖液(pH 7.7)中的酶溶液(0.5 mg/mL)在不同溫度下(4～65℃)溫浴10 min后測定其殘存活力。為測定SaDERA在最適反應溫度(45℃)下的活力半衰期，小份酶液(20 μL)在不同的時間點取出并測定其殘余活力。

1.5.3 乙醛耐受性

為檢測 SaDERA對乙醛的耐受性，含有100 mmol/L Tris－HCl緩沖液(pH 7.7)和300 mmol/L乙醛的酶溶液(0.5 mg/mL)在25℃下溫浴。在不同的時間取出小份酶液(20 μL)并通過微型超濾管(Amicon Ultra 0.5 mL，Ultracel 10k)除去乙醛［13］。在用100 mmol/L Tris－HCl(pH 7.7)稀釋到原體積之后，測定其殘余活力。

1.6 連續(xù)縮合反應及產(chǎn)物鑒定

1.6.1 分析方法

薄層層析(TLC)條件:展層劑為乙酸乙酯(EA);顯色劑為茴香醛顯色劑(V(茴香醛)∶V(濃H2SO4)∶V(H2O)=5∶10∶85);火上烘烤顯色。連續(xù)縮合產(chǎn)物2，4，6－三脫氧己糖的比移值約為0.5，顯灰綠色。

MS條件:電噴霧電離源正離子模式(ESI+)，選擇反應監(jiān)視(SRM)掃描模式，噴霧電壓4.5 kV，霧化氣流量6 L/min，離子傳輸毛細管溫度180℃，碰撞氣為N2，掃描頻率1.0 Hz。

1.6.2 連續(xù)縮合反應及產(chǎn)物鑒定

反應溶液(10 mL):100 mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH=7.4)，0.3 mol/L乙醛，8 mg純酶。反應條件:25℃水浴，100 r/min振搖。以TLC監(jiān)視反應進程，3 d后結束反應。加2倍體積的丙酮終止反應后，冰上靜置15 min，離心除去蛋白。40℃下減壓旋蒸反應液至1 mL，用制備TLC進行純化。刮下的產(chǎn)物用乙酸乙酯(EA)重溶后，過濾，蒸干。取0.25 mg溶于1 mL milli－Q水中，進樣到MS以檢測其相對分子質量。

2 結果與討論

2.1 生物信息學分析

SaDERA(登錄號BAB43223)由220個氨基酸殘基組成。由ExPASy網(wǎng)站上的ProtParam功能知:SaDERA的理論相對分子質量為2.334×105，理論pI為4.71。氨基酸多序列比對(圖1)結果顯示，SaDERA 與 來 源 于 Paenibacillussp.EA001(PaeDERA)［12］，Thermococcus kodakaraensis KOD1(TkDERA)［14］、Yersinia sp.EA015(YerDERA)［15］、Thermotogamaritima(TmDERA)［13］、Pyrobaculum aerophilum (PaDERA)［13］、 Aeropyrum pernix(ApDERA)［10］和 Escherichia coli K12(EcDERA)［11］的 DERAs序列一致性分別為 64.0%、51.7%、51.5%、47.3%、29.0%、28.5%和27.4%。

圖1 SaDERA與已知的DERAs的多序列比對Fig.1 Multiple sequence alignment for SaDERA and the other reported DERAs

EcDERA中涉及形成Schiff堿調節(jié)羥醛縮合反應的關鍵殘基(Asp102、Lys167和 Lys201)在SaDERA中完全保守(分別對應 Asp89、Lys151和Lys180)。在EcDERA中，Lys167與底物形成Schiff堿，而在立體空間中Lys167接近的Asp102、Lys201涉及供體醛的立體選擇性的質子化轉移過程［17］。因此，推斷SaDERA可能具有催化能力。

Desantis等［18］報道了EcDERA的磷酸結合口袋由 Gly171、Lys172、Gly204、Gly205、Val206、Arg207、Ser238和Ser239組成。而在SaDERA中，對應的殘基依 次 是 Gly155、Phe156、Gly183、Gly184、Val185、Arg186、Thr200和 Arg201。156(按 SaDERA 編號，下同)位的氨基酸殘基由堿性的Lys置換為疏水的Phe，增加了磷酸結合口袋的疏水性;238位的氨基酸殘基由Ser置換為鏈更長的Thr，而增大了磷酸結合口袋的空間位阻;201位的氨基酸殘基由中性的Ser置換為堿性的Arg，改變了磷酸結合口袋的靜電環(huán)境。這些改變將使得SaDERA與非磷酸取代的醛類化合物的結合能力增強，從而有助于連續(xù)縮合反應的進行。

2.2 重組SaDERA的表達純化

SaDERA具有良好的可溶性，37℃誘導即可表達出大量可溶蛋白。由圖2可知，由于SaDERA帶了His6標簽，通過一步簡單的鎳柱純化即可得到電泳純的目的酶(圖2，泳道PE)。

圖2 SaDERA的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of SaDERA

SaDERA純酶的比酶活是118.9 U/mg(表1)，是相同條件下來自PaeDERA的比酶活(62 U/mg)的 2 倍［12］。

2.3 SaDERA亞基數(shù)

通過凝膠過濾層析(Superdex 20010/300 GL)，SaDERA的保留體積為14.1 mL，因此SaDERA全酶的相對分子質量約為5.57×104。由SDS-PAGE知，其單體相對分子質量為2.55×104，所以該酶在溶液中以同源二聚體形式存在，此結果與已報道的DERA的亞基數(shù)一致。

表1 SaDERA的蛋白純化過程Table 1 Purification of target enzyme

2.4 基本酶學性質

SaDERA的酶學性質分析如圖3所示。由圖3(a)和圖3(b)可知:SaDERA最適反應條件為pH 7.7。它能在一個較寬的pH范圍(6.5～9.5)內呈現(xiàn)出相對較高的反應活力(最適活力的80%以上)。另外，SaDERA在相同pH的不同緩沖液下的活性相似，因此，緩沖液的差別對活性影響不大。

由圖3(c)和圖3(d)可知:SaDERA能穩(wěn)定地存在于中性或偏堿性的環(huán)境中，而且具有相當高的堿耐受性，在pH 11.0的緩沖液(100 mmol/L)中25℃溫浴24 h后仍有93%的殘余活力。SaDERA具有良好的耐熱性，在40℃溫浴10 min后能保持幾乎全部活力，然而隨著溫度繼續(xù)升高，其殘余活力逐漸減小。

2.5 乙醛耐受性

乙醛耐受性的實驗結果如圖4所示，由圖4可知:該酶在0.3 mol/L乙醛濃度下，30 min內保持了高于70%的殘余活力，在2 h后，其剩余活力仍大于50%，到達6 h后剩余活力下降為約40%，其后至24 h不再出現(xiàn)明顯下降。從其活力下降的曲線可以看到，在1 h內，活力下降速度最高，1 h內下降了約60%，但是之后變化逐漸放緩，這表明隨著時間的延長，大量的乙醛底物被醛縮酶催化生成縮合產(chǎn)物，降低了變性劑乙醛的濃度，進而導致酶失活速率的下降。這一結果與嗜熱來源的PaDERA和TmDERA相似，并且都遠優(yōu)于常溫來源的EcDERA:SaDERA在實驗條件下溫浴2 h后能保持54%的原活力;PaDERA和TmDERA在同樣的條件下溫浴2 h后保持60% ～70%的原活力，EcDERA在同樣的條件下溫浴2 h后幾乎完全喪失活力［12］。這表明SaDERA有潛力替代研究最充分的EcNAL而成為有價值的工業(yè)催化劑。

圖3 SaDERA的酶學性質分析Fig.3 Characterization of the purified SaDERA

圖4 SaDERA的乙醛耐受性Fig.4 Effects of acetaldehyde on enzyme stability

2.6 動力學參數(shù)

SaDERA的表觀動力學參數(shù)也被測定，結果如表2所示。由表2可知:SaDER的 kcat/Km為175 L/(mmol·s)，這與研究最充分的高活力的EcDERA相似［18］，而與已報道的 PaeDERA［12］具有同樣較高的乙醛耐受。這顯示出SaDEAR具有一定的應用潛力。

2.7 連續(xù)縮合反應及產(chǎn)物鑒定

為了進一步確定SaDERA的連續(xù)羥醛縮合的性能，以乙醛為底物進行了連續(xù)羥醛縮合反應，并通過制備TLC進行了產(chǎn)物純化和質譜檢測。結果如圖5所示。由圖5(a)可知:在25℃下反應20 h后即有大量產(chǎn)物生成，而EcDERA卻幾乎檢測不到產(chǎn)物的生成［12］。由圖5(b)可知:產(chǎn)物為2，4，6 － 三脫氧己糖(C6H12O3)，即乙醛連續(xù)兩次自縮合的產(chǎn)物，單一同位素的理論質荷比(m/z)為132.0786，理論加鈉峰為155.0684，實測為155.0640。分離產(chǎn)率39.5%。結果表明SaDERA具有催化連續(xù)羥醛反應的能力，而且明顯優(yōu)于研究最充分的EcDERA。

表2 SaDERA與其他DERAs的表觀動力學參數(shù)Table 2 Apparent kinetics parameters of SaDERA and the other DERAs

圖5 縮合產(chǎn)物鑒定Fig.5 Identification of aldol product

3 結論

采用基因挖掘技術，一種來自Staphylococcus aureus N315的DERA被發(fā)現(xiàn)并進行了鑒定。SaDERA具有一些明顯的優(yōu)勢，如乙醛耐受性強、耐堿、催化活性高、可溶表達量高;應特別指出的是，SaDERA具有比已商業(yè)化的EcDERA更強的乙醛耐受性以及比其他一些已報道的DERA更高的比活力或kcat/Km值。SaDERA及構建的工程菌有可能成為一種新的工業(yè)催化劑。隨著生物催化技術應用和發(fā)展，獲得寬底物譜、高穩(wěn)定性、高立體選擇性的新型DERA將是今后的研究重點。

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