何小慶，曹文紅，趙子科，章超樺

(廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室，廣東普通高等學(xué)校水產(chǎn)品深加工重點實驗室，國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心(湛江)，廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院，廣東 湛江，524088)

波紋巴非蛤(Paphia undulata)俗稱“花甲螺”、“花蚶”，系辯鰓綱簾蛤目簾蛤科，在我國廣泛分布于福建、廣東、廣西等沿海地區(qū)，福建省云霄縣東山灣是波紋巴非蛤主產(chǎn)區(qū)，年產(chǎn)量近4 萬t［1］。但以帶殼鮮銷為主，部分去殼取肉冷凍加工出口或加工成干制品、罐頭、蛤油，其利用價值和經(jīng)濟效益均不高，是一種尚未得到充分利用的海洋貝類資源。

研究表明波紋巴非蛤肉蛋白質(zhì)含量高，是良好的貝類蛋白質(zhì)資源［2］。關(guān)于水產(chǎn)尤其是貝類蛋白的分離與純化及性質(zhì)問題，目前研究還較少［5－7］，而對波紋巴非蛤的研究主要集中于養(yǎng)殖［3］、凈化［4］等方面，對其蛋白組分及性質(zhì)研究尚未見報道。本研究參照日本學(xué)者Saito［8］的方法，將波紋巴非蛤蛋白分為肌漿蛋白、肌原纖維蛋白、基質(zhì)蛋白，并對各蛋白組分的含氮量、分子量分布及其溶解性和濁度等進行了測定和分析，旨在為波紋巴非蛤蛋白資源的深加工和綜合利用提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

新鮮的波紋巴非蛤開殼取肉，去內(nèi)臟，用蒸餾水洗凈，分裝(每份約50g)，置于超低溫冰箱中。

1.2 主要儀器設(shè)備及試劑

數(shù)顯pH 25C 酸度計，上?？祪x儀器有限公司;Sigma 3K3 高速冷凍離心機，貝朗國際生物工程公司;FA2104A 電子分析天平，上海天平儀器廠;T18 baisc 高速組織搗碎機，德國IKA 集團公司;VULCAN.3 －550 PD. 馬福爐，美國VULCAN 公司;SB-5200 超聲波清洗機，海新芝生物技術(shù)研究所;UV-2102 紫外/可見分光光度計，尤尼柯儀器有限公公司;DYCZ-24EN 電泳槽，北京六一儀器廠;DYY-2C 電泳儀，北京六一儀器廠;Tanon GIS-2008 凝膠成像儀，上海天能科技有限公司，電泳蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)品購自Takara 大連寶生物工程有限公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗方法

1.3.1 基本營養(yǎng)成分的測定

水分的測定:常壓干燥法(GB/T5009.3 －2010);粗蛋白的測定:微量凱氏定氮法(GB/T5009.3 －2003);灰分的測定:高溫灼燒法(GB/T5009.4 －2010);粗脂肪的測定:索氏提取法(GB/T5009.6 －2003);總糖含量的測定:蒽酮比色法。

1.3.2 蛋白質(zhì)分離方法

提取溫度除非特別說明均為0 ～4℃。參照Saito等［8］的方法，將波紋巴非蛤肉分散于3 倍體積預(yù)冷的0.05 mol/L，pH7.0 的PBS 緩沖液中，高速組織勻漿機勻漿5min，4℃條件下浸提90 min(不時攪拌)，離心(10 000 r/min，15 min，4℃)，收集上清液，將沉淀分散于3 倍體積預(yù)冷的0.05 mol/L，pH7.0 的PBS 緩沖液中，重復(fù)上述操作，得上清液和沉淀S1。收集兩次離心后的上清液，按1∶1 的比例加入10%的TCA，離心(10 000 r/min，15 min，4℃)，上清液即非蛋白氮組分，沉淀S2 用丙酮漂洗3 次，除去TCA，然后揮發(fā)掉丙酮，用冰水溶解即得肌漿蛋白組分。將沉淀S1分散于3 倍體積的0.1 mol/L，pH 7.0，含1.0 mol/L NaCl 的磷酸鹽緩沖液中，高速組織勻漿機勻漿5 min，4℃下浸提18 h(不時攪拌)，離心(10 000 r/min，15min，4℃)，收集上清液，將沉淀分散于3 倍體積的0.1 mol/L，pH 7.0，含1.0 mol/L NaCl 的磷酸鹽緩沖液中，重復(fù)上述操作，收集兩次離心后的上清液，即為肌原纖維蛋白組分，所得沉淀部分即為基質(zhì)蛋白組分。肌原纖維蛋白透析脫鹽，可得脫鹽的肌原纖維蛋白。

1.3.3 蛋白組分含量測定

所有蛋白質(zhì)組分和非蛋白氮含量測定均采用微量凱氏定氮法。

1.3.4 蛋白質(zhì)分子量分布測定

采用5%濃縮，12%分離膠對分離后的波紋巴非蛤蛋白質(zhì)組分進行SDS-PAGE 電泳分析。考馬斯亮藍R-250 染色2 h，用脫色液(乙醇∶冰醋酸∶蒸餾∶水=25∶8∶67)脫色2 h。用Alphalmager HP 凝膠成像系統(tǒng)拍照。

1.3.5 濁度測定

取一定量2 mg/mL 的蛋白質(zhì)溶液經(jīng)不同條件處理后，室溫(25℃)靜置20 min，測定吸光度(A340)。

1.3.6 溶解度測定

測定濁度后的蛋白溶液在4℃、5 000 r/min 下離心15 min，取上清液測定蛋白溶解度。溶解度計算:

2 結(jié)果與討論

2.1 波紋巴非蛤基本營養(yǎng)組成

波紋巴非蛤與其他貝類的基本營養(yǎng)組成比較見表1。新鮮波紋巴非蛤肉含水量占82.07%，除水分之外含量最高的是粗蛋白，占原料12.33%，總糖占原料1.63%、粗脂肪占0.72%、灰分占0.83%。與關(guān)志強等［9］測得波紋巴非蛤粗蛋白含量(12.15%)相比，在誤差范圍之內(nèi)，這可能是由實驗條件及不同季節(jié)波紋巴非蛤本身營養(yǎng)組成存在差異所引起的誤差。以干基計，波紋巴非蛤粗蛋白含量占68.77%，均高于 同 屬 的 文 蛤 (51.53%)［10］、美 洲 簾 蛤(60.69%)［11］、菲律賓蛤仔(61.28%)［12］，與近江牡蠣、馬氏珠母貝相比，略低于馬氏珠母貝(74.9%)［13］，比 近 江 牡 蠣(50.63%)［14］高 出18.14%，粗脂肪含量均低于以上這5 種常見的雙殼貝。由此可知，波紋巴非蛤具有高蛋白低脂肪的特點，是一種值得重視的蛋白質(zhì)資源。

表1 波紋巴非蛤與其他貝類基本營養(yǎng)組成比較 %Table 1 Nutrition composition of Paphia undulata compared with other shellfishes %

2.2 波紋巴非蛤蛋白質(zhì)組成

本文根據(jù)1.3.2 描述的方法對波紋巴非蛤肉蛋白質(zhì)進行分離，除非蛋白氮外，得到3 個蛋白質(zhì)組分:肌漿蛋白組分、肌原纖維蛋白組分和基質(zhì)蛋白組分，各蛋白質(zhì)組分占波紋巴非蛤肉總蛋白比例見圖1。

圖1 波紋巴非蛤肉蛋白質(zhì)組成Fig.1 Protein compositions of Paphia undulata

從圖1 可以看出，波紋巴非蛤肌原纖維蛋白組分占原料總蛋白比例最大，達45.42%，依次是肌漿蛋白(31.2%)、基質(zhì)蛋白(20.69%)、非蛋白氮含量占1.67%，非蛋白氮中主要成分為游離氨基酸、小肽及核苷酸等物質(zhì)，這可能與波紋巴非蛤味道鮮美有著極密切的關(guān)系。與其他水產(chǎn)動物不同，貝類的軟體部分(可食部分)沒有骨骼組織，其組織與結(jié)構(gòu)主要由蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)組成，特別是肌原纖維蛋白和基質(zhì)蛋白。肌原纖維蛋白在肉的加工和貯存中起到非常重要的作用，不僅與肌肉收縮有關(guān)，還與肉制品的流變學(xué)特性如黏結(jié)性、保水性、彈性、質(zhì)地等有密切的關(guān)系，在糜類肉制品和重組肉制品的質(zhì)構(gòu)特性中起主要作用。因此，若將波紋巴非蛤肉添加到其他肉制品中，可以獲得具有貝類風(fēng)味肉制品新品種。

波紋巴非蛤在凍藏過程中易發(fā)生冷凍變性，這可能與其肌原纖維蛋白所占的比例有關(guān)。在貝肉蛋白質(zhì)變性中，肌原纖維蛋白變性比Ca2+-ATPase 活性變化幅度要大，說明貝肉的肌球蛋白桿部比頭部更容易發(fā)生變性，這與對魚類的研究結(jié)論一致［15］。

2.3 波紋巴非蛤蛋白質(zhì)分子量分布

文本采用12%的分離膠，5%的濃縮膠對波紋巴非蛤各蛋白分離組分進行SDS-PAGE 電泳分析，用Alphalmager HP 凝膠成像系統(tǒng)拍照得到的電泳圖譜如圖2 所示。

圖2 蛋白質(zhì)組分SDS-PAGE 電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE of protein components

SDS-PAGE 電泳分析圖譜顯示，3 種蛋白質(zhì)組分亞基分子量主要位于200 ～29.0 kDa;其中肌漿蛋白條帶較多、亞基分子量分布比較廣泛;肌原纖維蛋白組分分子量大多介于66.4 ～200 kDa 和29.0 ～38.0 kDa，200 kDa 處為肌球蛋白重鏈譜帶(MHC)，45 kDa附近處為肌動蛋白譜帶，原肌球蛋白分布在35 kDa附近，小于20 kDa 為肌球蛋白輕鏈(MLC)，分布在100 kDa 附近的蛋白質(zhì)條帶則為副肌球蛋白，條帶顏色較深，說明其所占比例較大。副肌球蛋白是無脊椎動物特有的肌原纖維蛋白質(zhì)，與雙殼貝閉殼肌的特殊運動有關(guān)，在雙殼貝的閉殼肌中含量特別多，研究表明扇貝貝柱中副肌球蛋白占肌原纖維蛋白質(zhì)的50%以上［16］;基質(zhì)蛋白組分在190、97、44、29 kDa 有明顯的蛋白條帶。本次研究中，分離所得的基質(zhì)蛋白沒有作進一步分離處理，所得基質(zhì)蛋白中含有少量的堿溶性蛋白組分，因此在低分子量范圍內(nèi)也出現(xiàn)了蛋白條帶。

2.4 溫度對肌漿蛋白和肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響

在室溫、pH7.0 下考察溫度對肌漿蛋白和肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響?？疾鞙囟赛c為25、35、45、55、65、75 和85℃，當(dāng)溫度達到相應(yīng)值時立即取出試管于冰水中冷卻，測定濁度和溶解度。

圖3 溫度對肌漿蛋白、肌原纖維蛋白溶液濁度和溶解度的影響Fig.3 Effect of heating temperature on turbidity and solubility of myosinogen and myofibril protein solution

由圖3 可知:肌漿蛋白與肌原纖維蛋白受溫度的影響變化趨勢相似。在25 ～45℃時，肌漿蛋白與肌原纖維蛋白溶解度變化不顯著，說明在此溫度范圍內(nèi)蛋白質(zhì)未發(fā)生明顯變性，而濁度在此溫度范圍內(nèi)變化不明顯也可進一步反映出蛋白質(zhì)變性情況;肌漿蛋白在55 ～65℃內(nèi)，肌原纖維蛋白在45 ～55℃變化區(qū)間內(nèi)溶解度均顯著降低(P＜0.05)，說明此時蛋白質(zhì)發(fā)生了明顯的變性聚集，濁度在此溫度范圍內(nèi)顯著增大(P＜0.05)，這是由于加熱促使蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，蛋白質(zhì)單體損失，疏水基團暴露后發(fā)生聚集導(dǎo)致［17］;當(dāng)加熱溫度超過55℃，肌原纖維蛋白溶解度先緩慢下降后又逐漸上升，濁度緩慢增加，變化不顯著，當(dāng)加熱溫度超過65℃后，肌漿蛋白溶解度緩慢減小、濁度緩慢增大，變化都不顯著。此外，Paredi等［18］報道扇貝肌球蛋白的變性溫度為41.7 ～55.0℃。由此可以初步推測，波紋巴非蛤肌漿蛋白的熱變性溫度可能在55℃附近，肌原纖維蛋白的熱變性溫度可能在45℃附近。

2.5 pH 值對肌漿蛋白和肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響

在室溫(20 ～25℃)下考察pH 對肌漿蛋白和肌原纖維蛋白濁度和溶解性的影響。取濃度為2 mg/mL 的蛋白溶液，用0.5 mol/L 的HCl 或NaOH 溶液調(diào)pH 分別至3.5、4.5、5.5、6.5、7.5、8.5 和9.5，緩慢攪拌30 min，測濁度，離心(4℃，5 000 g，15 min)，所得上清液用于測定蛋白質(zhì)溶解度，結(jié)果見圖4。

圖4 pH 值對肌漿蛋白、肌原纖維蛋白溶液濁度和溶解度的影響Fig.4 Effect of pH on turbidity and solubility of myosinogen and myofibril protein solution

由圖4 可知:(1)在實驗范圍內(nèi)，肌漿蛋白的溶解性都較好，溶解度均大于71%，pH5.5 ～6.5 溶解性較低;在pH6.5 附近濁度達到最大，隨后隨pH 值增加而下降;(2)pH 對肌原纖維蛋白溶解度影響較大，在中性或堿性條件下肌原纖維蛋白的溶解性較好，在酸性條件下，肌原纖維蛋白的溶解性較差，當(dāng)pH ＜4.5 時，溶解度隨pH 值增大而降低，在pH4.5時降至最小，隨后顯著增大(P＜0.05);蛋白溶液濁度變化情況則相反。當(dāng)pH ＞6.5 時，溶解度和濁度增大或減少到一個穩(wěn)定范圍，變化不顯著。這與王耀耀等［19］對鮑魚腹足肌原纖維蛋白的溶解度和濁度研究所得變化趨勢有相似性。這可能是由于蛋白質(zhì)屬于兩性分子，當(dāng)環(huán)境pH 高于或低于等電點時，蛋白質(zhì)帶負電荷或正電荷，水分子同這些電荷相互作用并起穩(wěn)定作用，從而增加了蛋白質(zhì)的溶解性，對濁度的影響較小;當(dāng)pH 值接近等電點時，蛋白質(zhì)分子同水的作用較弱，使肽鍵能相互靠攏，有時能形成聚集體而導(dǎo)致蛋白質(zhì)沉淀，從而使得溶解度降低，濁度升高。另外pH 對豬肉［20］、魚肉［21］的肌球蛋白二級結(jié)構(gòu)變化有不同程度的影響，因此當(dāng)溶液的pH 從6.5 降低到4.5 時，肌原纖維蛋白所帶凈電荷和空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，導(dǎo)致溶解度降低，濁度升高。

2.6 離子強度對肌原纖維蛋白濁度和溶解度的影響

由于肌原纖維蛋白是用鹽溶液提取的，而肌漿蛋白是用離子強度很低的磷酸緩沖液提取的，故本次實驗未考慮離子強度對肌漿蛋白濁度和溶解度的影響。

由圖5 可知，離子強度從0.2 mol/L 增大到0.6 mol/L 的過程中，波紋巴非蛤肌原纖維蛋白的濁度顯著下降(P＜0.05)，溶解度顯著升高(P＜0.05);當(dāng)離子強度大于0.6 mol/L 時，隨離子強度增加，濁度和溶解度變化不顯著。這可能是因為離子強度能夠改變氨基酸側(cè)鏈電荷分布，降低或增加蛋白質(zhì)之間的相互作用，改變肌原纖維蛋白的狀態(tài)，從而影響其理化性質(zhì)。肌原纖維蛋白不溶于水而溶于鹽溶液，在低離子強度下(＜0.4)形成均一的纖絲，所以濁度大而溶解度小，而在高離子強度下(＞0.4)形成分散的單體，處于可溶狀態(tài)，因此濁度小而溶解度大。

圖5 離子強度對肌原纖維蛋白溶液濁度和溶解度的影響Fig.5 Effect of ionic strength on turbidity and solubility of myosinogen and myofibril protein solution

3 結(jié)論

(1)新鮮波紋巴非蛤肉含水量為82.07%，粗蛋白12.33%，粗脂肪0.72%，灰分0.83%，總糖1.63%。對其蛋白組分分析結(jié)果表明，波紋巴非蛤蛋白中肌原纖維組分占原料粗蛋白的45.42%，肌漿蛋白蛋白組分占31.2%，基質(zhì)蛋白組分占20.69%，非蛋白氮占1.67%。

(2)波紋巴非蛤蛋白組分分子量分布范圍寬，但各組分之間又存在較大差異。肌漿蛋白組分亞基分子量分布比較廣泛，在200 ～29.0 kDa 之間;肌原纖維蛋白組分分子量大多介于66.4 ～200 kDa 和29.0～38.0 kDa 之間;基質(zhì)蛋白組分在190 kDa、97 kDa、44 kDa、29 kDa 有明顯的條帶。

(3)肌漿蛋白與肌原纖維蛋白濁度和溶解度受溫度影響的變化趨勢相似;pH 值對肌漿蛋白濁度和溶解度影響較小，對肌原纖維蛋白溶液濁度和溶解度影響較大;在實驗范圍內(nèi)，離子強度下降，肌原纖維蛋白溶液的濁度上升，溶解度下降。

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