陳仕學(xué)，沈家國(guó)，陳波，王大忠，張廷海

(銅仁學(xué)院生物科學(xué)與化學(xué)系，貴州 銅仁，554300)

陽荷(Zingiber strioatum)，又名洋姜、山姜、野山姜等，屬于姜科姜屬多年生草本植物。陽荷是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高、食藥同源的膳食纖維蔬菜，富含蛋白質(zhì)、氨基酸和豐富的膳食纖維多糖類物質(zhì)［1］。其多糖具有極其重要的生理功能，如降血脂、延緩衰老、抗腫瘤等功效。目前對(duì)陽荷的研究主要有色素和蛋白質(zhì)的提取研究，而對(duì)陽荷多糖的提取研究未見報(bào)道，原因是多糖的結(jié)構(gòu)組成非常復(fù)雜，提取分離十分困難，所以選擇一種合適的提取分離方法對(duì)陽荷多糖的研究具有重大意義［2］。本研究采用微波法輔助提取陽荷多糖，為進(jìn)一步開發(fā)利用本地野生陽荷及后續(xù)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料:野生陽荷，將采于梵凈山附近林中的野生陽荷，洗凈，切碎，曬干，置于60℃烘箱干燥，室溫密封保存?zhèn)溆谩?/p>

試劑:NaOH 固體，天津市大茂化學(xué)試劑廠;Cu-SO4，廣東汕頭市西隴化工廠;無水乙醇、95%乙醇，天津市富宇精細(xì)化工有限公司;蒽酮 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;葡萄糖 天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;鹽酸、濃硫酸、遵義師范學(xué)院化工試劑廠，以上試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純;水為二重蒸餾水。

儀器:T6 新世紀(jì)型紫外分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;MM823EC8-PS(X)型美的微波爐，佛山市順德區(qū)美的微波電器制造有限公司;101-3 型電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京科偉永興儀器有限公司;SHZ-D(Ⅲ)型循環(huán)水式真空泵，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;AR124CN 型電子天平，奧豪斯儀器上海有限公司;80-2 型離心沉淀機(jī)，江蘇金壇市中大儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法［3－4］

選材→烘干→脫脂→烘干→粉碎→過篩→加浸提劑攪勻→微波處理→過濾→濾液濃縮→除蛋白→離心取濾液→脫色→無水乙醇沉淀→靜置12h→過濾→干燥

將已烘干的陽荷干品在常溫下用5 倍體積的乙酸乙酯浸泡3h，用蒸餾水清洗殘留的有機(jī)溶劑至樣品無味，將其置于60℃的烘箱內(nèi)烘干，得脫脂樣品。在脫脂樣品中加入浸提劑，適當(dāng)條件下微波處理，將樣品過濾，取濾液水浴濃縮至1/2 體積。用Sevag［V(三氯甲烷)∶V(正丁醇)=4∶1］試劑除蛋白，離心去沉淀，向?yàn)V液加入4%H2O2溶液除色素。并加入4倍體積無水乙醇室溫靜置12h，將沉淀物置于70℃干燥箱中干燥，平行實(shí)驗(yàn)3 次，求平均值，計(jì)算多糖的提取率。

數(shù)據(jù)處理和圖表繪制用Microsoft Excel2003 和SPSS16.0 進(jìn)行進(jìn)行，平行實(shí)驗(yàn)3 次，取平均值。

1.2.1 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取經(jīng)過干燥的陽荷(粉碎后過20 目篩)1.000 0 g，置于100 mL 錐形瓶中，加入一定量的蒸餾水，用微波法對(duì)其進(jìn)行多糖提取，在常溫下過濾，取濾液1 mL，加入5 mL 無水乙醇，搖勻，靜置24 h，3 000 r/min 離心20 min，去上清液，濾渣用2 mol/L H2SO4溶液溶解后，加水定容至10 mL，搖勻，備用。

1.2.2 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和蒽酮-硫酸試劑的配制

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:精密稱取105℃下干燥至恒重的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品10 mg，置于100 mL 容量瓶中，加蒸餾水溶解并定容至刻度，搖勻，得0.1 mg/mL 的葡萄糖樣品溶液，備用。

2 mol/L H2SO4溶液:準(zhǔn)確移取111.11 mL 濃H2SO4溶液，定容至1 L，用于溶解多糖。

蒽酮-硫酸溶液配制:精確稱取蒽酮粉末0.100 0 g 加入100 mL 的錐形瓶中，加入濃度為80% 的H2SO4，定容至100 mL，備用。

1.2.3 浸提劑的確定

分別用蒸餾水、不同濃度的乙醇溶液作為陽荷多糖的浸提劑，用紫外分光光度計(jì)測(cè)出吸光度，得出最佳浸提劑。

1.2.4 微波提取條件的優(yōu)化［5－6］

分別以最佳浸提劑為溶劑，對(duì)不同料液比、浸提時(shí)間和功率進(jìn)行單因素試驗(yàn)，并對(duì)料液比、時(shí)間和功率采用L9(33)進(jìn)行正交試驗(yàn)，通過正交分析，得出微波提取陽荷多糖的最佳提取工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析［7 －10］

2.1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別從葡萄糖樣品溶液中精密移取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL 置于試管中，加蒸餾水定容至2 mL，精密加入蒽酮-硫酸溶液6 mL。置于沸水中加熱15 min 后取出，放入冰浴中冷卻，以相應(yīng)的空白試劑作對(duì)照，在波長(zhǎng)為625 nm 下，以吸光度A 為縱坐標(biāo)，葡萄糖含量c(μg/mL)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖1)，得回歸方程為:A=0.0364C+0.0624，R2=0.9992。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard curve

由此可以得出多糖提取率的計(jì)算公式:

提取率/% =［(A－0.062 4)/0.036 4 ×10 ×V/m/1000］×100

式中:A為吸光度;m為稱取陽荷質(zhì)量，g;V為浸提液體積，mL。

2.2 浸提劑的確定

用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇和蒸餾水為浸提劑提取陽荷多糖，結(jié)果見表1。

表1 不同浸提劑對(duì)提取率的影響Table 1 Influence of different extracting agent on the extraction ratio

由表1 可知，本實(shí)驗(yàn)用70%的乙醇作為提取陽荷多糖的最佳浸提劑。

2.3 單因素實(shí)驗(yàn)

2.3.1 提取時(shí)間的影響

準(zhǔn)確稱取過20 目篩干燥陽荷粉1.000 0 g，料液比為1∶20(g∶mL)，中火(440 W)下分別提取1、2、3、4、5 min。按1.2.1 中樣品溶液的制備及2.1 中標(biāo)準(zhǔn)曲線制作的方法分別實(shí)驗(yàn)，測(cè)其吸光度，并代入回歸方程中求其多糖提取率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 作用時(shí)間對(duì)提取率的影響Fig.2 Influence of different acting time on the extraction ratio

由圖2 可知，隨著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，陽荷中多糖的提取率逐漸增加，在4 min 時(shí)多糖的提取率達(dá)到最大，超過4 min 后，多糖提取率隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸下降。可能是多糖的浸出率達(dá)到了動(dòng)態(tài)平衡，多糖氧化分解速度逐漸增加所致，故選擇4 min 作為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件的浸提時(shí)間。

2.3.2 料液比的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g 陽荷粉，料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g∶mL)，中火(440 W)作用下浸提4 min，按1.2.1 中樣品溶液的制備及2.1 中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法分別實(shí)驗(yàn)，測(cè)其吸光度，并代入回歸方程中求其多糖提取率，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對(duì)提取率的影響Fig.3 Influence of different solid-liquid ratio on the extraction ratio

由圖3 可知，料液比為1∶30(g∶mL)之內(nèi)時(shí)，多糖提取率逐漸增加，料液比超過1∶30(g/mL)后，提取率逐漸下降，這可能是多糖的溶出率已達(dá)到平衡，過多的溶劑造成多糖的損失。故選擇1∶30(g∶mL)作為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件的最佳料液比。

2.3.3 微波功率的影響

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g 陽荷粉，料液比1 ∶30(g/mL)，微波功率分別為低火(136 W)、中低火(264 W)、中火(440 W)、中高火(616 W)、高火(800 W)下浸提4 min。按1.2.1 中樣品溶液的制備及2.1 中標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法分別實(shí)驗(yàn)，測(cè)其吸光度，并代入回歸方程中求其多糖提取率，結(jié)果見圖4。

圖4 微波功率對(duì)提取率的影響Fig.4 Influence of different microwave power on the extraction ratio

由圖4 可知，隨著提取功率的增加，陽荷多糖的提取率隨之增加，當(dāng)提取功率為中低火時(shí)達(dá)到最大，之后隨提取功率的增加而逐漸下降?？赡苁怯捎诠β实脑黾釉斐啥嗵茄趸纸馑?，故選擇提取功率為中低火作為進(jìn)一步優(yōu)化提取條件的最佳功率。

2.4 正交試驗(yàn)

為了確定在提取過程中各因素的影響大小，本研究對(duì)微波法提取陽荷多糖的3 個(gè)單因素即提取時(shí)間(A)、料液比(B)、微波功率(C)進(jìn)行正交試驗(yàn)，并以多糖提取率作為提取工藝的判斷依據(jù)。根據(jù)設(shè)置選用L9(33)正交表，試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2 和表3。

表2 正交試驗(yàn)因素水平表Table 2 The factor levels of the orthogonal test

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果及極差分析Table 3 The results of orthogonal test and range analysis

由表3 極差分析結(jié)果顯示，3 個(gè)因素對(duì)陽荷多糖提取率的影響依次為:提取時(shí)間＞微波功率＞料液比。正交優(yōu)化條件為A1B1C2，即提取時(shí)間為3 min，料液比為1∶20(g∶mL)，微波功率為中火(264 W)。

2.5 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)［11］

為了考察上述工藝的穩(wěn)定性，按微波法提取陽荷多糖的最佳工藝條件A1B1C2，即提取時(shí)間為3 min，料液比為1∶20(g∶mL)，提取功率為中火的條件下分別進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)5 次，分別測(cè)定其多糖提取率，計(jì)算其RSD ，結(jié)果見表4。

表4 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 4 The verification testing results

由表4 可知，在此工藝條件下，多糖平均提取率為13.01%，優(yōu)于正交實(shí)驗(yàn)中任何一組，RSD 為0.44%，說明該工藝穩(wěn)定。

2.7 三種提取方法比較［12］

同法采用常規(guī)浸提法得出陽荷多糖的最佳提取條件為:料液比為1∶40(g∶mL)，提取時(shí)間為80 min，提取溫度為90℃，陽荷多糖的提取率平均值為5.05%;超聲波輔助法最佳提取條件料液比為1∶30(g∶mL)，提取時(shí)間為30 min，提取溫度為70℃，在此條件下陽荷多糖的提取率平均值為8.18%。3 種提取方法比較見表5。

表5 常規(guī)提取、超聲波與微波提取法效率比較Table 5 The comparation of the extraction efficiency among the conventional method，ultrasonic method and the microwave-assisted method

由表5 可知，微波輔助提取法具有提取時(shí)間短、耗材少、提取效率高等優(yōu)點(diǎn)，故可用于工業(yè)上大規(guī)模生產(chǎn)。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)采用微波法、常溫浸提和超聲波法提取陽荷多糖，對(duì)陽荷多糖的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。微波輔助提取的最佳工藝條件為:浸提時(shí)間3 min，料液比1∶20(g∶mL)，微波功率為中火，多糖的提取率為13.01%，且穩(wěn)定性高;采用常規(guī)浸提法的最佳提取工藝條件為:料液比1∶40(g∶mL)，浸提時(shí)間80 min，浸提溫度90℃，多糖的提取率平均值為5.05%;超聲提取的工藝條件:料液比1∶30(g∶mL)，浸提溫度70℃，浸提時(shí)間30 min，超聲功率100 W，多糖提取率為8.18%。采用微波法輔助提取陽荷多糖具有操作簡(jiǎn)單，時(shí)間短，提取率高，能耗低等優(yōu)點(diǎn)，可以廣泛用于工業(yè)上多糖的生產(chǎn)。

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