汪君民，龔騰云

Institute ofSports Science， Nantong University， Nantong 226007，Jiangsu，China

視黃醇結(jié)合蛋白4(RBP4)主要是由脂肪細(xì)胞分泌的，是特異性結(jié)合視黃醇的蛋白質(zhì)中的一類［1］。研究發(fā)現(xiàn)，RBP4這一脂肪因子會導(dǎo)致胰島素抗性，對胰島素抗發(fā)展起到一個(gè)關(guān)鍵作用，在具有胰島素抗性的小鼠體內(nèi)及肥胖、2型糖尿病病人體內(nèi)，血清RBP4的水平升高［2］。升高的RBP4水平與心血管危險(xiǎn)因子關(guān)系密切，并且可用來作胰島素抵抗程度的評價(jià)［3］。研究表明，運(yùn)動訓(xùn)練可以降低不同年齡階段的研究對象的RBP4水平［3－4］，提示運(yùn)動可以通過RBP4水平的降低來提高胰島素的敏感性。

糖尿病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，但最近炎癥學(xué)說頗受關(guān)注，認(rèn)為炎癥在其發(fā)病機(jī)制中起重要的媒介作用。其中多種細(xì)胞因子包括許多白細(xì)胞介素介導(dǎo)了此類反應(yīng)。白細(xì)胞介素通過自分泌、內(nèi)分泌和旁分泌的方式加速或者抑制此類炎癥反應(yīng)的過程。而其中的IL－2與糖尿病的發(fā)病和進(jìn)程，以及與糖尿病相關(guān)的心血管疾病的關(guān)系最為密切，并且IL－2還具有炎癥和免疫系統(tǒng)之外的重要調(diào)節(jié)作用，如通過全身給藥IL－2能阻止非肥胖糖尿病小鼠的病程［5］等。而在胰島素抵抗情況下，運(yùn)動導(dǎo)致IL－2及其受體水平如何變化目前未見相關(guān)報(bào)道。

本研究采用重組RBP4注射活體大鼠，獲得高RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠模型，觀察運(yùn)動后胰島素抵抗和免疫指標(biāo)變化，為臨床控制胰島素抵抗及糖尿病和其心血管并發(fā)癥提供新的思路和靶點(diǎn)。

1 研究材料與方法

1.1 材料

胰島素(Sigma－Aldrich)、2－Deoxy－D－［I－3H］－glucose(Sigma－Aldrich)、RBP4ELISA 試劑盒(Biosource)、胰島素放射免疫試劑盒(Biogenesis)、重組 RBP4(Alexis)、IL－2、IL－2R 定量試劑盒，淋巴細(xì)胞亞群檢測試劑盒均購自廈門慧嘉生物技術(shù)公司，以及酶聯(lián)免疫檢測儀，流式細(xì)胞儀(FCM)(Beckman Coulter)等儀器。

1.2 方法

1.2.1 重組 RBP4注射與運(yùn)動方案

雄性SD大鼠8周齡22只，體重183～211 g，隨機(jī)分成RBP4+運(yùn)動組(RE)10只、RBP4安靜組(RR)6只，2 組大鼠給予重組 RBP4 腹腔注射［2］，3 μg/g 體重，每12小時(shí)一次，持續(xù)注射4周。其余6只為安靜對照組(C)。RE組大鼠按照Ploug方法［6］進(jìn)行游泳訓(xùn)練4周，泳池為直徑53 cm內(nèi)壁光滑的塑料桶，水深70 cm，水溫為35℃ ±2℃，游泳訓(xùn)練開始時(shí)間為晚上6點(diǎn);大鼠 先進(jìn)行每天15分鐘適應(yīng)性游泳訓(xùn)練共2天，從第3天開始采取每天無負(fù)重游泳，每次持續(xù)60 min，每周訓(xùn)練6天，周日休息，共持續(xù)4周。訓(xùn)練中，大鼠如出現(xiàn)反復(fù)下沉或溺水傾向，及時(shí)撈出，休息后片刻，再投入水中，直至補(bǔ)足60 min訓(xùn)練時(shí)間;同時(shí)使用小木棍及時(shí)驅(qū)趕，使大鼠持續(xù)運(yùn)動，避免其出現(xiàn)抱團(tuán)、漂浮等現(xiàn)象，保證訓(xùn)練效果。將安靜對照組大鼠在浸水后撈出。游泳結(jié)束后撈出，以干毛巾擦拭，暖風(fēng)機(jī)吹干。

1.2.2 血清RBP4和胰島素抵抗指數(shù)的檢測

采用雙抗體夾心酶標(biāo)免疫分析法測定RBP4;采用放射免疫分析法測定胰島素。采用穩(wěn)態(tài)模式評估法評價(jià)胰島素敏感性，其原理是:假設(shè)外周組織和肝臟的胰島素抵抗相等，按胰島素和血葡萄糖在周圍組織、肝和胰腺等不同器官的相互影響而建立起來的數(shù)學(xué)模型。模型的計(jì)算公式為:HOMA－IR(穩(wěn)態(tài)模型的胰島素抵抗指數(shù))=空腹胰島素(國際單位/L)×以空腹葡萄糖(mmoL/L)/22.5。

1.2.3 免疫學(xué)指標(biāo)檢測

外周血中 IL－2、IL－2R的含量檢測用 ELISA法;CD4、CD8的活性測定用S－P一步法;均參照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.4 胸腺及脾臟指數(shù):用分析天平稱取胸腺及脾臟重量后，計(jì)算依據(jù)下列公式:胸腺(或脾臟)指數(shù)(g/100 g)=100×胸腺(或脾臟)重量/體重。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0程序處理，以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示，Kolmogorov－Smirnov檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的正態(tài)分布，組間進(jìn)行方差分析，采用 LSD檢驗(yàn)，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清RBP4和胰島素抵抗指數(shù)變化

4周后，RE組和RR組大鼠血清 RBP4水平顯著高于C組(P＜0.01);RE組大鼠血清RBP4水平顯著低于RR組(P＜0.01);RE組和 RR組大鼠 HOMAIR顯著高于C組(P＜0.01);RE組大鼠HOMA－IR顯著低于RR組(P＜0.01)(見表1)。

表1 血清RBP4和胰島素抵抗指數(shù)變化

2.2 外周血中IL－2、IL－2R的表達(dá)變化

表2 外周血中IL－2、IL－2R的表達(dá)變化

4周后，RR組和C組大鼠外周血IL－2、IL－2R表達(dá)差異不大;RE組大鼠外周血IL－2表達(dá)高于RR組(P＜0.05)，而IL－2R表達(dá)明顯低于 RR組(P＜0.05);其比值高于 RR 組(P ＜0.01)。

2.3 外周血中CD4、CD8活性及CD4/CD8比值變化

表3 外周血中CD4、CD8活性及CD4/CD8比值變化

4周后，RR組和C組大鼠外周血CD4、CD8活性及CD4/CD8比值差異不大;RE組大鼠外周血CD4活性明顯高于RR組(P＜0.05)，而CD8活性明顯低于RR 組(P ＜0.05);其比值高于 RR 組(P＜0.01)。

2.4 大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的變化

表4 大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)的變化

4周后，RR組與C組大鼠相比，體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)都有所下降(P＜0.05);而RE組與C組大鼠相比體重?zé)o顯著差異，與RR組比胸腺指數(shù)(P＜0.05)、脾臟指數(shù)明顯提高(P ＜0.01)。

3 討論

3.1 大鼠血清 RBP4變化情況

胰島素抵抗不僅是2型糖尿病的發(fā)病基礎(chǔ)，還是代謝綜合征(糖尿病、肥胖、高血壓病、動脈粥樣硬化、脂肪肝等疾病)的共同的病理基礎(chǔ)。胰島素能夠提高組織對葡萄糖的攝取率，機(jī)制是胰島素與靶細(xì)胞的胰島素信號蛋白相互作用，最終能夠增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體從細(xì)胞內(nèi)池向細(xì)胞膜的運(yùn)動［7］。胰島素在不同的組織、細(xì)胞中通過復(fù)雜的信號級聯(lián)放大作用發(fā)揮不同的生理作用。

本研究中，大鼠經(jīng)過RBP4注射4周后，與C組相比，RE組和RR組大鼠均出現(xiàn)胰島素抵抗;對RBP4注射后的大鼠進(jìn)行運(yùn)動干預(yù)后發(fā)現(xiàn)，雖然大鼠血清RBP4水平仍高于C組，但與RR組比明顯下降。與此對應(yīng)的是:RE組和RR組大鼠胰島素抵抗指數(shù)顯著高于C組，RE組大鼠明顯低于RR組。說明運(yùn)動能夠抵抗RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗。

3.2 大鼠外周血IL－2及IL－2R表達(dá)變化情況

IL－2是由Th細(xì)胞IL抗原或絲裂原刺激下和IL－1誘導(dǎo)下分泌的一種15KD的糖蛋白，能夠促進(jìn)淋巴細(xì)胞有絲分裂，增強(qiáng)殺傷細(xì)胞(如T殺傷細(xì)胞、NK細(xì)胞)的殺傷功能和輔助抗體生成等，在機(jī)體的免疫應(yīng)答及調(diào)節(jié)中起著重要的作用。血清中IL－2水平是末梢血單核細(xì)胞功能的一個(gè)敏感而又量化的指標(biāo)，它可以影響其他組織或體液成分的免疫活性。白細(xì)胞介素2受體有兩種，即存在于細(xì)胞表面的IL－2膜受體(mIL－2R)和存在于體液中的可溶性IL－2受體(IL－2R)，這兩種受體都可結(jié)合IL－2，中和活化T細(xì)胞周圍過多的白介素2，具有免疫調(diào)控作用。IL－2的生物學(xué)作用是通過和靶細(xì)胞上特異性高親和力的IL－2R相互作用來完成的。Tarnok等［8］研究發(fā)現(xiàn)，CPB(體外循環(huán))術(shù)后外周血中的IL－2含量明顯減少，并且減少的程度與CPB的時(shí)間相關(guān)。而王東等［9］學(xué)者認(rèn)為，CPB使血中可溶性IL－2受體(IL－2R)含量明顯增加，IL－2R與IL－2這兩種成分結(jié)合使IL－2失活，從而抑制免疫反應(yīng)。因此，一定程度上可將IL－2/IL－2R系統(tǒng)水平作為衡量機(jī)體免疫水平的指標(biāo)之一。王會平［10］研究表明:IL－2對大鼠的心臟收縮功能具有明顯抑制作用;可明顯改善糖尿病(高葡萄糖濃度)誘發(fā)的血管內(nèi)皮依賴性舒張功能減弱;可減弱高葡萄糖濃度誘發(fā)的冠狀動脈血管阻力的升高。

本研究結(jié)果表明，RE組與RR組大鼠血清IL－2表達(dá)升高、IL－2R表達(dá)降低(P＜0.05)，且IL－2/IL－2R比值明顯增大(P＜0.01)，其升高機(jī)理可能是4周運(yùn)動訓(xùn)練作用于激活的T淋巴細(xì)胞，使其對IL－2R表達(dá)與釋放減少，而IL－2R可結(jié)合血清中的IL－2，具有免疫抑制作用，這與文獻(xiàn)報(bào)告的基本一致［11］。結(jié)合王會平的研究結(jié)果，說明運(yùn)動不但能夠改善胰島素抵抗大鼠的免疫機(jī)能，而且能夠改善心臟舒張功能，減弱冠狀動脈血管阻力的升高，為胰島素抵抗患者提供了鍛煉防治糖尿病的科學(xué)依據(jù)。

3.3 大鼠外周血CD4、CD8活性及CD4/CD8比值變化

機(jī)體特異性免疫的重要組成部分之一是細(xì)胞免疫，T淋巴細(xì)胞是細(xì)胞免疫的效應(yīng)細(xì)胞。其中CD4+T細(xì)胞主要是識別外源性多肽抗原，包括TI(誘導(dǎo)性T細(xì)胞)和Th(輔助性T細(xì)胞)兩種;CD8+T細(xì)胞主要是識別內(nèi)源性多肽抗原，包括Ts(抑制性T細(xì)胞)和Tc(細(xì)胞毒性T細(xì)胞)兩種。CD4+和CD8+通過相互制約來維持免疫功能的平衡，二者的比值下降提示免疫抑制。

本研究測定結(jié)果，RE組大鼠外周血CD4活性明顯高于RR組，CD8活性明顯低于RR組，CD4/CD8比值明顯增加。揭示運(yùn)動訓(xùn)練對胰島素抵抗大鼠的免疫功能有一定的正性調(diào)節(jié)作用。

3.4 大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)組間關(guān)系

胸腺和脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，其結(jié)構(gòu)、功能的正常與否直接關(guān)系到機(jī)體的免疫功能是否正常。胸腺是T淋巴細(xì)胞發(fā)育、成熟的部位，為中樞免疫器官。脾是人體最大的外周免疫器官，是B淋巴細(xì)胞發(fā)育、成熟的，也是機(jī)體在抗原刺激下發(fā)生免疫應(yīng)答的場所。故胸腺、脾臟結(jié)構(gòu)的衰退和功能下降勢必會影響機(jī)體的體液、細(xì)胞免疫功能，導(dǎo)致機(jī)體免疫功能失調(diào)。胸腺指數(shù)和脾指數(shù)是依據(jù)機(jī)體體重來計(jì)算的，與體重成正比，故胸腺指數(shù)、脾指數(shù)是直接反映胸腺、脾免疫功能的重要指標(biāo)［12］，兩者的高低變化反映了機(jī)體體內(nèi)免疫功能的狀態(tài)。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，RR組大鼠體重、胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均低于對照組C組，表明RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠體重胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)明顯降低。而RE組胸腺指數(shù)、脾臟指數(shù)均高于RR組，則說明耐力運(yùn)動能顯著提高模型大鼠胸腺指數(shù)及脾臟指數(shù)，提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)防病抗病能力。

3.5 研究缺陷和進(jìn)一步研究的方向

本試驗(yàn)只采用了游泳這種單一的練習(xí)方式，沒有設(shè)置專門的力量練習(xí)組。而有文獻(xiàn)認(rèn)為，適當(dāng)?shù)牧α炕蚩棺枇Ψ桨冈O(shè)計(jì)對不適合進(jìn)行走、慢跑、有氧健身操等練習(xí)的2型糖尿病患者是可行而且有效的［13］。規(guī)律運(yùn)動可能通過調(diào)節(jié)胰島素抵抗大鼠的炎癥狀態(tài)，提高患者的自身免疫力，達(dá)到防治糖尿病的目的，然而具體采用的運(yùn)動方式、運(yùn)動強(qiáng)度、頻度、持續(xù)時(shí)間等都還需要更多的運(yùn)動試驗(yàn)進(jìn)行探討。

4 結(jié)論

RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠免疫功能有所下降;運(yùn)動提高RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠Th細(xì)胞分泌IL－2的能力，減少存在于細(xì)胞表面游離的可溶性受體(IL－2R)的表達(dá)與釋放;運(yùn)動能夠明顯提升RBP4誘導(dǎo)的胰島素抵抗大鼠免疫能力。該研究在探討胰島素抵抗患者免疫功能紊亂的發(fā)生機(jī)制、臨床治療和預(yù)后判斷方面有重要意義。

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