賈明峰 趙龍 席亞明 陳徹 楚惠媛 郭敏 成娟 李明 張豪 傅思武

艱難梭菌(Clostridium difficile)是引起偽膜性腸炎及抗生素相關(guān)性腹瀉的主要致病菌之一,可產(chǎn)生毒素A和毒素B。毒素A(Tcd A)被認(rèn)為是艱難梭菌引起疾病發(fā)生的最主要的致病因子,對(duì)pH值和溫度變化具有較強(qiáng)的適應(yīng)性。毒素A具有腸道毒性、細(xì)胞毒性、小鼠致死活性、紅細(xì)胞凝集活性和血管通透性亢進(jìn)等多種生物學(xué)活性[1]。研究表明Tcd A對(duì)肝癌、白血病、結(jié)腸癌細(xì)胞均具有一定的誘導(dǎo)凋亡、增殖抑制作用[2,3]。本研究主要探討Tcd A對(duì)白血病細(xì)胞株K562的增殖、凋亡及相關(guān)機(jī)制研究,旨在為開(kāi)發(fā)的抗白血病藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 人慢性髓性白血病K562細(xì)胞株由蘭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心惠贈(zèng),于37℃、5% CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。艱難梭菌VPI 10463菌株由西北民族大學(xué)傅思武教授惠贈(zèng),濃度為0.14 mg/ml。

1.2 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml,接種于96孔板內(nèi),加入Tcd A,終濃度分別為50、100、200、400、800 ng/ml,以未處理的細(xì)胞為對(duì)照組,作用24、48、72 h,每孔加入10 μl MTT溶液(5 mg/ml),培養(yǎng)4h后加入裂解液,放置過(guò)夜,振蕩,溶解約10～15 min后,酶標(biāo)儀測(cè)定492 nm處吸光度。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率(inhibitory rate,IR)。IR=(對(duì)照組吸光度－實(shí)驗(yàn)組吸光度/對(duì)照組吸光度) ×100%。

1.3 PI單染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期K562細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml,實(shí)驗(yàn)組加入濃度為800 ng/ml的Tcd A,對(duì)照組為等量的未處理細(xì)胞懸液,作用48 h后收集細(xì)胞。PBS洗滌,重懸細(xì)胞于預(yù)冷的70%乙醇,4℃固定2 h,PBS洗滌,加入0.5 ml碘化丙錠(20 μg /ml),避光染色30 min,流式細(xì)胞儀分析。

1.4 RT-PCR法檢測(cè)細(xì)胞BCL-2,Bax,Egr-1mRNA的表達(dá)取對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106個(gè)/ml,實(shí)驗(yàn)組分別加入Tcd A,終濃度依次為50、100、200、400、800 ng/ml,對(duì)照組為等量的未處理細(xì)胞懸液。作用48h后,按照Trizol法提取總RNA,根據(jù)cDNA第一鏈反應(yīng)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳PCR,BIO-RAD凝膠成像分析儀上觀(guān)察結(jié)果并照相,Quantity One軟件分析結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 結(jié)果顯示,不同濃度的Tcd A作用于K562細(xì)胞后均能抑制細(xì)胞的增殖,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。隨著TcdA濃度的增大,抑制率逐漸增加,呈劑量依賴(lài)性(表1)。Tcd A濃度為800 ng/ml,作用48 h時(shí)的抑制率最大,為47.67%,半數(shù)抑制濃度(IC50)約為 375.83 ng/ml。

表1 Tcd A對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用(±s,n=3)

表1 Tcd A對(duì)K562細(xì)胞的增殖抑制作用(±s,n=3)

注：與對(duì)照組相比*P＜0.05

TcdA(ng/ml) 24h 48h 72h A492nm IR(%) A492nm IR(%) A492nm IR(%)0 0.412±0.011 - 0.675±0.016 - 0.752±0.023 -50 0.311±0.002 24.51* 0.544±0.012 19.40* 0.689±0.007 8.38 100 0.299±0.015 27.42* 0.512±0.004 24.15* 0.641±0.009 14.76 200 0.268±0.008 34.95* 0.461±0.009 31.71* 0.609±0.006 19.02*400 0.241±0.002 41.50* 0.381±0.005 43.56* 0.596±0.005 20.74*800 0.229±0.004 44.41* 0.360±0.004 47.67* 0.587±0.006 21.94*

圖1 Tcd A對(duì)K562細(xì)胞凋亡的影響

2.3 RT-PCR檢測(cè)K562細(xì)胞內(nèi)Bcl-2,Bax,Egr-1 mRNA的表達(dá)。

不同濃度的Tcd A作用于K562細(xì)胞48h后,隨著藥物濃度增加,Bcl-2基因mRNA的表達(dá)量逐漸下降,Bax基因mRNA的表達(dá)量逐漸增加,Egr-1基因mRNA的表達(dá)量逐漸增加。運(yùn)用Quantity one軟件分析各條帶灰度值,實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組相比,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(圖 2)。

圖2 Tcd A對(duì)K562細(xì)胞Bcl-2,Bax,Egr-1mRNA表達(dá)的影響

3 討論

Tcd A是一種外毒素,通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞而發(fā)揮細(xì)胞毒作用。本研究顯示,不同濃度的TcdA對(duì)白血病K562細(xì)胞均有較強(qiáng)的增殖抑制作用,作用48 h時(shí)的抑制率達(dá)到47.67%,并隨著藥物劑量的增大抑制率逐漸增大,呈劑量依賴(lài)性。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果提示,給藥48 h后正常細(xì)胞的二倍體峰前出現(xiàn)明顯的亞二倍體峰,即凋亡峰。因此TcdA能誘導(dǎo)K562細(xì)胞發(fā)生凋亡。

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞在凋亡基因的調(diào)控下,啟動(dòng)內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶而發(fā)生的程序性死亡[4]。線(xiàn)粒體/細(xì)胞色素C介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑是主要細(xì)胞凋亡途徑之一。細(xì)胞在凋亡信號(hào)如DNA損傷、神經(jīng)酰胺、Ca2+過(guò)載等刺激下,線(xiàn)粒體膜通透性改變,釋放細(xì)胞色素C,進(jìn)而在A(yíng)TP/dATP存在下,與Apaf-1、Caspase-9前體形成凋亡體,誘導(dǎo)procaspase活化,進(jìn)而激活Caspase-3,最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。現(xiàn)普遍認(rèn)為,細(xì)胞色素C的釋放與Bcl蛋白家族成員有關(guān)。Bcl蛋白家族分為兩類(lèi),一類(lèi)是抗凋亡蛋白(Bcl-2、Bcll、Bcl-w等),另一類(lèi)是促凋亡蛋白(Bax、Bak、Bid和Bad等)。細(xì)胞在受到各種刺激后,線(xiàn)粒體外膜間的通透轉(zhuǎn)變孔道開(kāi)放,基質(zhì)和胞漿內(nèi)的離子得以平衡流動(dòng),線(xiàn)粒體基質(zhì)呈現(xiàn)高滲狀態(tài),線(xiàn)粒體腫脹,外膜破裂,膜間隙中的促凋亡蛋白釋放,引起細(xì)胞凋亡[5]。Bcl-2蛋白則減少Ca2+的釋放,防止線(xiàn)粒體發(fā)生腫脹,抑制細(xì)胞色素C的釋放。而B(niǎo)ax等促凋亡蛋白通過(guò)直接或間接途徑形成Bax的異源/同源二聚體,促進(jìn)通透轉(zhuǎn)變孔道開(kāi)放?？沟蛲龅鞍譈cl-2等過(guò)表達(dá),與Bax蛋白形成異源性二聚體,抑制通透轉(zhuǎn)變孔道開(kāi)放[6]。因此人們認(rèn)為抗凋亡蛋白Bcl-2與促凋亡蛋白Bax的失衡是腫瘤發(fā)生的機(jī)制之一[7]。本研究中,艱難梭菌毒素A作用K562細(xì)胞48h后,隨著藥物濃度的增加,Bcl-2 mRNA表達(dá)下調(diào),Bax mRNA表達(dá)上調(diào)。

Egr-1基因?yàn)榧纯淘缙诜磻?yīng)基因,位于人類(lèi)5號(hào)染色體q23-31,具有誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、分化,促進(jìn)細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)作用。而其誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制主要是調(diào)節(jié)TGFβ的表達(dá),誘導(dǎo)野生型P53和下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)?？嘴`玲等[8]將外源性的Egr-1質(zhì)粒導(dǎo)入乳腺癌細(xì)胞株后,研究發(fā)現(xiàn),隨著Egr-1表達(dá)的增加,caspase-3表達(dá)水平增加,p-gp表達(dá)水平下降,細(xì)胞發(fā)生顯著地凋亡。本研究結(jié)果顯示,隨著TcdA濃度的增加,Egr-1基因的表達(dá)水平增加,且與Bcl-2 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述,TcdA作用于白血病K562細(xì)胞株,能夠抑制細(xì)胞的增殖,促進(jìn)細(xì)胞的凋亡。而其機(jī)制與Bcl-2表達(dá)下調(diào),Bax以及Egr-1的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。艱難梭菌毒素A作用于白血病細(xì)胞,是否還有其他機(jī)制參與,需要我們更加深入的研究。

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