陳晉廣 ，賴維 ，姜昱

（1.廣東省中山市人民醫(yī)院，中山528403；2.浙江省臺(tái)州市立醫(yī)院，臺(tái)州318000；3.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣州510630）

銀屑病是皮膚科常見(jiàn)的復(fù)發(fā)性炎癥性自身免疫性皮膚病，目前大量研究提示，CD4+T細(xì)胞即T輔助性細(xì)胞（helper T cells，Th）在銀屑病的發(fā)病中起著重要作用。在不同的條件下，初始CD4+T淋巴細(xì)胞可分化成不同T淋巴細(xì)胞亞群，包括Th1/Th2型、輔助性 T細(xì)胞17（T helper 17 Cells,Th17）/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell,Treg），發(fā)揮不同的生物學(xué)效應(yīng)。其中，Th17、Treg亞群是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的Th細(xì)胞新亞群,在腫瘤、感染性疾病以及自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)。筆者前期研究發(fā)現(xiàn)，尋常性銀屑病Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子IL-17、IL-23表達(dá)升高，NB-UVB光療可有效降低患者外周血中IL-17、IL-23的表達(dá)[1]。窄譜中波紫外線（narrow-band ultraviolet B，NB-UVB）治療銀屑病臨床療效較好，但其作用機(jī)制仍未完全明了。本研究以Th17、Treg為觀察指標(biāo)，分別對(duì)銀屑病患者接受NB-UVB光療前、后Th17/Treg變化情況進(jìn)行檢測(cè)，探討NB-UVB治療銀屑病的免疫學(xué)機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 病例資料 61例尋常性銀屑病患者均來(lái)自2012年4月—2013年4月本院皮膚科門診和住院患者。其中男32例,女29例；年齡19～48歲，平均（29.0±3.5）歲；病程3～10年。50例本院門診的健康體檢人員作為正常對(duì)照組，其中男26例，女24例；年齡 20～50歲，平均（30.0±2.5）歲。2組研究對(duì)象在性別、年齡等方面比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。所有研究對(duì)象對(duì)實(shí)驗(yàn)知情同意并簽署知情同意書(shū)，實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 患者近1個(gè)月內(nèi)接受過(guò)系統(tǒng)性抗銀屑病治療或半個(gè)月內(nèi)局部應(yīng)用相關(guān)藥物治療者；妊娠期、哺乳期患者；伴有其他嚴(yán)重性系統(tǒng)性疾病或皮膚疾?。挥凶贤饩€照射禁忌證人群。

1.3 光療方法 使用窄譜中波紫外線光療儀（德國(guó)沃曼公司，波長(zhǎng)為310～315 nm、峰值311 nm）進(jìn)行治療。首次光療劑量為70%的最小紅斑量（minimal erythema doses，MED），隔日 1次；后續(xù)光療劑量在前次劑量基礎(chǔ)上按局部皮膚反應(yīng)依次遞增10%～20%，至光療區(qū)皮膚出現(xiàn)淡紅斑時(shí)則維持該劑量進(jìn)行治療。治療過(guò)程中若出現(xiàn)疼痛性紅斑或水泡時(shí)應(yīng)停止光照，至皮損恢復(fù)后再繼續(xù)照射，劑量為前次劑量的50%。20次為1個(gè)療程。

1.4 PASI評(píng)定 分別于光療前、光療10次及光療20次后計(jì)算PASI積分，病情改善率（%）=[(治療前PASI評(píng)分-治療后PASI評(píng)分)∕治療前PASI評(píng)分]×100%。臨床療效分為治愈（病情改善率≥90%）、顯效（病情改善率在60%～89%）、好轉(zhuǎn)（病情改善率在25%～59%）和無(wú)效（病情改善率＜25%）4個(gè)等級(jí)。有效率=[（治愈+顯效）/總治療人數(shù)]×100%。

1.5 Th17和CD4+CD25+Treg亞群檢測(cè) 所有研究對(duì)象分別抽取治療前后清晨空腹外周靜脈血約5 mL，肝素抗凝淋巴細(xì)胞分離液以Ficoll密度梯度法分離出外周血淋巴細(xì)胞,1%小牛血清PBS沖洗,制備淋巴細(xì)胞懸液（濃度1×109/L）。取淋巴細(xì)胞懸液置于48孔培養(yǎng)板內(nèi),每孔1 mL，加50 μg/L佛波酯、1 mg/L離子霉素和莫能菌素2 μmol/L，孵箱（德國(guó)HERAEUS 公司，37 ℃、5%CO2）中培養(yǎng) 5 h。收集細(xì)胞分為實(shí)驗(yàn)管和對(duì)照管,加入20 μL PE-Cy5標(biāo)記的鼠抗人CD4單抗（美國(guó)e Bioscience公司）混勻，放置20 min（室溫、避光），對(duì)細(xì)胞表面抗原進(jìn)行染色。加200 μL Cytofix/Cytoperm液,在4℃下放置20 min，通透和固定細(xì)胞，洗滌。實(shí)驗(yàn)管分別加入10 μL FITC標(biāo)記的鼠抗人CD25抗體（美國(guó)e Bioscience公司）、FITC標(biāo)記的IL-17抗體（美國(guó)e Bioscience公司），對(duì)照管加入同型對(duì)照抗體，孵育30 min后（4℃、避光），用Perm/Wash液1 mL洗滌2次，以300 μL洗滌液重懸細(xì)胞，采用流式細(xì)胞儀（EPICS-XL COULTER）于24 h內(nèi)檢測(cè)分析。以CD4直方圖設(shè)門區(qū)分Th細(xì)胞（CD4＋），最終以散點(diǎn)圖IL-17、CD25染色陽(yáng)性分別表示Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞，數(shù)據(jù)用Cellsquest軟件分析。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本研究采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行分析，2組比較采用t檢驗(yàn)，用Spearman秩相關(guān)系數(shù)進(jìn)行分析，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 光療前后PASI積分比較 患者光療10次（15.21±1.11）與 20 次后的 PASI（10.21±1.10）比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；光療10次后PASI評(píng)分與光療前（25.31±6.93）相比，患者的PSAI積分顯著降低，癥狀明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。其中治愈10例，顯效38例，好轉(zhuǎn)13例，無(wú)效0例，有效率為78.7%。

2.2 光療前后Th17/Treg比較 光療前銀屑病患者Th17細(xì)胞表達(dá)明顯高于對(duì)照組（P<0.05），Treg細(xì)胞表達(dá)與正常組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；患者Th17/Treg表達(dá)高于對(duì)照組（P＜0.05），且與PASI評(píng)分呈正相關(guān)（r＝0.490，P＜0.05）?；颊吖獐?10次、光療20次后的Th17細(xì)胞表達(dá)、Th17/Treg均呈顯著下降（P＜0.05），但仍高于對(duì)照組（P＜0.05）；患者Treg細(xì)胞表達(dá)在各個(gè)治療階段均無(wú)明顯改變（P＞0.05）。詳見(jiàn)表 1。

表1 光療前、后不同階段Th17/Treg比較

3 討論

Th17細(xì)胞是近期發(fā)現(xiàn)的有別于傳統(tǒng)Th1/Th2細(xì)胞分化途徑CD4+T新亞型，以分泌IL-17為主要特征。Treg細(xì)胞在分化途徑和功能上則與Th17相對(duì)抗，對(duì)機(jī)體部分效應(yīng)性及自身反應(yīng)性T細(xì)胞具有選擇性抑制作用；兩者在正常生理狀態(tài)下保持動(dòng)態(tài)平衡，維持免疫穩(wěn)定。近年來(lái)隨著對(duì)Th17/Treg研究的深入，使人們對(duì)多種自身免疫性疾病發(fā)病機(jī)制有了新的認(rèn)識(shí)。Th17細(xì)胞在促炎反應(yīng)和中性粒細(xì)胞的動(dòng)員、募集以及活化反應(yīng)中起到重要的作用；有研究發(fā)現(xiàn)，Th17細(xì)胞及相關(guān)的細(xì)胞因子可能是銀屑病發(fā)病的重要病理基礎(chǔ)[2]。在銀屑病TGF-β1轉(zhuǎn)基因小鼠模型實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，IL-23/Th17途徑細(xì)胞因子水平增高，CD4+CD25+Treg細(xì)胞功能受損[3]。眾多研究提示，Th17/Treg參與了銀屑病的發(fā)病過(guò)程。

NB-UVB治療銀屑病安全性好、不良反應(yīng)少、應(yīng)用方便，在臨床治療中得到醫(yī)生和患者的一致青睞。筆者采用NB-UVB治療銀屑病臨床研究顯示,NB-UVB治療尋常性銀屑病有效率達(dá)78.7%，療效較好；治療中未出現(xiàn)嚴(yán)重的不良反應(yīng)，患者依從性好。實(shí)驗(yàn)研究還發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者Th17、Th17/Treg均明顯高于正常對(duì)照組（P<0.05），Treg與正常組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Th17/Treg表達(dá)與患者 PASI評(píng)分呈正相關(guān)性（r＝0.490，P＜0.05）。Zhang等[4]研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病機(jī)體循環(huán)中的Th17/Treg比值與患者PASI積分呈正相關(guān)，與本結(jié)果一致。光療10次和光療20次后，患者PASI積分均得到不同程度的降低，提示NB-UVB可通過(guò)調(diào)節(jié)銀屑病患者外周血中Th17/Treg的失衡來(lái)發(fā)揮作用。近年來(lái)國(guó)外學(xué)者開(kāi)展了許多針對(duì)Th17/Treg干預(yù)的實(shí)驗(yàn)研究[5]，如抗腫瘤壞死因子拮抗劑依那西普，可通過(guò)逆轉(zhuǎn)Th1/Th17細(xì)胞的活化上調(diào)Th2、Treg亞群，達(dá)到治療銀屑病的作用。因此，基于Th17/Treg失衡的研究，不僅解釋或完善銀屑病部分發(fā)病機(jī)制，而且可能為銀屑病臨床治療提供新方向。

[1] 陳晉廣,賴維,姜昱，等.窄譜中波紫外線對(duì)銀屑病的療效及外周血IL-17和IL-23的影響 [J].中華物理醫(yī)學(xué)與康復(fù)雜志,2013，35（3）:218-219.

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